芹菜素對A375黑色素瘤生長、遷移和血管生成的影響及其作用機制

徐紅濤，韓中保，張慧麗，馬林偉，王旻晨（.鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院臨床醫(yī)學教研室，江蘇鹽城4005；.蘇州大學醫(yī)學院解剖系，江蘇蘇州53）

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芹菜素對A375黑色素瘤生長、遷移和血管生成的影響及其作用機制

徐紅濤1，韓中保1，張慧麗1，馬林偉1，王旻晨2
（1.鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院臨床醫(yī)學教研室，江蘇鹽城224005；2.蘇州大學醫(yī)學院解剖系，江蘇蘇州215123）

摘要：目的探討芹菜素對A375黑色素瘤增殖、遷移和血管生成的影響及其作用機制。方法采用四唑氮化合物（MTS）法檢測芹菜素對人黑色素瘤A375細胞增殖的影響；裸鼠皮下移植瘤模型考察芹菜素對體內(nèi)黑色素瘤生長的影響；劃痕實驗檢測芹菜素對細胞體外遷移的影響；小管形成實驗檢測芹菜素對人黑色素瘤血管生成的影響；Western blot檢測芹菜素對A375細胞中調(diào)控增殖及血管生成相關(guān)蛋白表達的影響，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、磷酸化P38（p-P38）、總蛋白P38（t-P38）、磷酸化Erk（p-Erk）、總蛋白Erk（t-Erk）。結(jié)果體外芹菜素處理A375細胞后，腫瘤細胞的體外增殖及體內(nèi)生長較空白對照組明顯受抑制；腫瘤細胞的遷移能力較溶劑對照組明顯減弱；小管形成實驗中，芹菜素能夠抑制腫瘤細胞誘導的血管生成；分子機制研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素能抑制血管生成相關(guān)蛋白VEGF及MMP-9的表達，同時芹菜素也能抑制調(diào)控腫瘤細胞增殖相關(guān)蛋白，如p-P38及p-Erk的表達。結(jié)論芹菜素能抑制A375黑色素瘤生長、遷移及血管生成，其機制可能與抑制調(diào)控腫瘤細胞增殖及血管生成相關(guān)蛋白的表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞：芹菜素；黑色素瘤；增殖；遷移；血管生成；分子機制

近年來，惡性黑色素瘤的發(fā)病率逐年升高，嚴重威脅人們的生活質(zhì)量。惡性黑色素瘤是一種惡性程度很高的腫瘤，其具有病情進展快、預后較差的特點，目前已成為皮膚癌中致患者死亡的首要因素[1-2]。該病多發(fā)生于歐美國家及大洋洲的澳大利亞、奧克蘭等地區(qū)[3]。研究證實，紫外線輻射是導致黑色素瘤發(fā)病的首要原因[4]，其他誘發(fā)因素還包括大氣污染、有機農(nóng)藥以及飲食習慣等。目前臨床上，國內(nèi)外對于黑色素瘤的治療主要以手術(shù)切除為主，該方法對尚未發(fā)生轉(zhuǎn)移的黑色素瘤效果較好，但對已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的黑色素瘤效果較差，且術(shù)后復發(fā)的風險較高[5]；化療對該病短時間內(nèi)療效明顯，但長期用藥后，藥物的毒副作用較大，給患者帶來很大痛苦[6]；放療雖然能將大部分腫瘤細胞殺死，但同時正常細胞也受到損傷，導致患者身體虛弱、免疫力下降[7]；癌化學預防是近些年來國外新興的治療腫瘤的方法，主要基于黑色素瘤是一種不斷進展的疾病，以及該病不同時期所對應的不同分子事件或通路可被合成的或天然來源的化合物靶向[8]。但是該方法到目前為止仍然沒有很好地發(fā)展起來，其中一個主要原因是臨床上與癌化學預防藥物檢測相關(guān)的邏輯及程序上的困難尚無法克服[9]，使該方法用于黑色素瘤的治療對科研界仍然是一個很大的挑戰(zhàn)。近年來，飲食療法在腫瘤的預防及治療中愈來愈受到人們的重視[10]，通過長期飲食實現(xiàn)對疾病的控制甚至達到治療的效果。芹菜是目前世界上食用度很廣的蔬菜之一[11]，已被作為飲食療法的一種食材。研究發(fā)現(xiàn)，芹菜中的主要活性成分為芹菜素[12]。其藥理研究表明，芹菜素具有多種藥理作用，如抗氧化[13]、抗炎[14]、調(diào)節(jié)免疫[15]及抗腫瘤等[16]，尤其是抗腫瘤功效受到較多的關(guān)注。目前，研究證實芹菜素對頭頸部細胞癌[17]、骨肉瘤[18]、肺癌[19]、前列腺癌[20]及結(jié)腸癌等[21]腫瘤細胞的增殖有抑制作用。但縱觀國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，有關(guān)芹菜素抗黑色素瘤的研究報道很少，且作用機制尚不清楚。本研究以A375黑色素瘤為研究對象，考察芹菜素對黑色素瘤增殖、遷移及血管生成的影響，并探討其可能的作用機制，為芹菜素的臨床應用提供相關(guān)實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗材料

人源性黑色素瘤細胞系A375和原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）（購自中國科學院上海細胞生物學研究所）。BALB/c裸鼠（雄性，6～8周齡，18～20 g），無特定病原體（specefic pathogen free，SPF）級，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2012-0001。芹菜素純度為98％，購自美國Sigma-Aldrich公司。10％胎牛血清、無血清細胞凍存（dulbecco modified eagle medium，DMEM）培養(yǎng)基、0.25％胰蛋白酶購自美國Gibco公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（美國PIERCE公司Cat.No.23227），Ⅰ型鼠尾膠原蛋白（天津衛(wèi)凱生物有限公司Cat.No.MAT1015 Lot.No.LQF20120221，包裝規(guī)格：10 mg），MatrigelTM基底膜基質(zhì)（美國BD公司Cat.No.356234 Lot.No.2342761包裝規(guī)格：5 ml）。Western blot檢測所涉及抗體：血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）（美國CST公司，Cat No：3852S），基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase，MMP-9）（CALBIO-CHEM，Cat No：IM51），總蛋白P38（total-P38，t-P38）/磷酸化P38（phosphorylation P38，p-P38）（1∶200，美國Abcam公司），總蛋白Erk（total-Erk，t-Erk）/磷酸化Erk（phosphorylation Erk，p-Erk）（1∶1 000，美國Cell Signaling Technology公司），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（美國Bioworld公司，Cat No：AP0063）。

1.2方法

1.2.1四唑氮化合物[3-（4,5-dimenthylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-tetrazolium，MTS]法檢測芹菜素對A375黑色素瘤細胞增殖的影響A375細胞用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5％二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞，用胰酶消化后離心計數(shù)，用DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為4.5×105個/ml，接種于96孔板，每孔200μl細胞懸液，常規(guī)培養(yǎng)至細胞增長至80％左右時，分別加1、2、4、8、16、32、64和128μmol芹菜素，與溶劑對照組[二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）]孵育24 h。每孔加入MTS試劑20μl，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。培養(yǎng)結(jié)束后，在490nm波長下測定吸光度值（optical density，OD）。細胞增殖抑制率（％）=（1-實驗組OD值/陰性對照組OD值）×100％。每個濃度設置6個復孔，實驗重復3次。

1.2.2A375裸鼠皮下移植瘤模型檢測芹菜素對腫瘤體內(nèi)生長的影響①將購買的BALB/c裸鼠適應性飼養(yǎng)1周。根據(jù)體重隨機分成兩組，隨機選擇其中一組作為模型組（只接種腫瘤細胞，不接受任何藥物處理）；②常規(guī)培養(yǎng)A375黑色素瘤細胞，實驗前4～5 d，按1∶8比例將細胞傳代于75 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，以免細胞生長過度而出現(xiàn)不完全融合。每個培養(yǎng)瓶大約含0.8×107～1.0×107個細胞，取對數(shù)生長期細胞，棄培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗2遍。加入1 ml 0.25％胰酶-0.02％乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），37℃消化1 min后，輕敲培養(yǎng)瓶使細胞脫落，加血清終止消化。轉(zhuǎn)移至10 ml離心管中，常溫1 000 r/min離心3 min，棄上清液。加PBS，吹打獲得單細胞懸液。通過細胞計數(shù)將懸液濃度調(diào)節(jié)至1×107個/ml，放置冰上備用；③用濃度為75％的酒精消毒皮膚，1 ml注射器吸取0.2 ml（2×106個細胞）A375細胞懸液接種至裸鼠右后肢的背部皮下，每注射2只裸鼠，充分混勻細胞懸液后繼續(xù)接種，接種完繼續(xù)飼養(yǎng)，每天觀察小鼠腫瘤的形成，測量腫瘤體積：用游標卡尺測量記錄瘤徑，長短徑各測3次，求得長徑均值a和短徑均值b，腫瘤體積=1/2×a× b2。接種7 d后，選擇造模成功的24只裸鼠，測定平均瘤體積和體重進行隨機分組，分為模型組、芹菜素低劑量組（10 mg/kg）、芹菜素高劑量組（40 mg/kg），每組8只，給藥21 d（藥物用食用油溶解，灌胃給藥；空白組與模型組給予不含藥的食用油）。每隔3 d稱取每只裸鼠的體重和瘤體積；④給藥21 d后各組裸鼠頸椎脫臼處死，剪開皮膚，小心剝離整個瘤塊，稱重、拍照后用4％多聚甲醛液固定，備用。

1.2.3劃痕實驗檢測芹菜素對A375黑色素瘤細胞遷移的影響A375細胞種至6孔板中，每孔加入濃度2×105個/ml細胞懸液2 ml，培養(yǎng)24 h后，細胞約長至80％～90％，吸棄上清，PBS洗1遍。用10μl槍頭沿孔的中線垂直劃痕，PBS洗2遍，加入含不同濃度對應藥物的無血清培養(yǎng)基，設5個組：溶劑對照組、0μmol芹菜素組、1μmol芹菜素組、2μmol芹菜素組和4μmol芹菜素組，0和24 h分別在100倍鏡下拍照。

1.2.4小管形成實驗①將96孔板和無菌移液槍頭置于-20℃冰箱中預冷過夜；將保存于-20℃冰箱中的MatrigelTM基底膜基質(zhì)置于4℃冰箱中，緩慢解凍過夜待用；②將預冷的96孔板置于冰板上，每孔加入100μl MatrigelTM基底膜基質(zhì)。將其置于4℃條件下10 min，再置于37℃、5％CO2及95％空氣的細胞培養(yǎng)箱中30 min；③取指數(shù)生長期的HUVEC細胞（100 mm培養(yǎng)皿），棄培養(yǎng)液。加10 ml PBS洗滌1次，棄去PBS后，加入4 ml 0.25％胰蛋白酶-0.02％ EDTA，37℃消化2 min后，向其加入5 ml完全培養(yǎng)基中和反應，吹打后將細胞轉(zhuǎn)入15 ml離心管中，1 000 r/min離心3 min。配細胞懸液，用適量的基礎培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1.5×105個/ml。96孔板，每孔緩慢加入100μl細胞混懸液；④除溶劑對照組，每孔加入等體積的A375細胞培養(yǎng)上清液0.2 ml進行培養(yǎng)。同時不同濃度的芹菜素（0～4μmol）作用24 h后，分別于顯微鏡下觀察管腔形成并拍照記錄。運用Image J軟件分析管腔生成的長度。

1.2.5Western blot檢測將約1×107個細胞加至蛋白裂解液，冰上靜置30 min，低溫12 000 r/min離心20 min，提取上清液。應用BCA定量法計算蛋白的濃度。取60μg總蛋白跑膠（恒壓100μV），電轉(zhuǎn)膜30 min。含5％脫脂奶粉的Tris緩沖鹽和吐溫20 （tris-buffered saline and tween 20，TBST）封閉1 h。一抗4℃冰箱過夜，二抗孵育1μh后顯影。VEGF、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、MMP-9以及GAPDH抗體購自美國Cell Signaling公司。

1.3統(tǒng)計學方法

采用Graphpad 5.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，用單因素方差分析和LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1芹菜素抑制A375細胞的體外增殖

體外不同濃度的芹菜素處理A375細胞24 h，結(jié)果表明，8μmol芹菜素初步抑制A375細胞的增殖，16和32μmol濃度時可以明顯抑制腫瘤細胞的增殖，并且呈現(xiàn)一定的量-效關(guān)系（見圖1）。本實驗得出結(jié)論，在一定濃度范圍內(nèi)，芹菜素能濃度依賴性地抑制A375黑色素瘤細胞的增殖。

圖1　芹菜素對A375黑色素瘤細胞增殖的影響

2.2芹菜素能抑制A375黑色素瘤的體內(nèi)生長

裸鼠體內(nèi)移植瘤實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，芹菜素能明顯減小A375黑色素瘤的體積和重量，且具有一定的劑量依賴性，表明芹菜素能抑制A375黑色素瘤的體內(nèi)生長。見圖2。

圖2　芹菜素對裸鼠A375黑色素瘤皮下移植瘤體內(nèi)生長的影響

2.3芹菜素能抑制A375黑色素瘤細胞的遷移

劃痕實驗中，選取對腫瘤細胞增殖無明顯抑制作用的濃度：1、2和4μmol芹菜素處理A375細胞24 h，結(jié)果表明，1μmol芹菜素初步抑制A375細胞的遷移，2和4μmol可以明顯抑制腫瘤細胞的遷移，并且具有一定的濃度依賴性（見圖3）。本實驗得出結(jié)論，芹菜素能抑制A375黑色素瘤細胞的遷移，且在一定濃度范圍內(nèi)，具有濃度依賴性。

圖3　芹菜素對A375黑色素瘤細胞遷移的影響（×200）

2.4芹菜素能抑制黑色素瘤細胞條件培養(yǎng)下HUVEC形成小管的能力

小管形成實驗中，選取4個不同濃度：0、1、2和4μmol芹菜素處理A375細胞24 h，結(jié)果表明，培養(yǎng)腫瘤細胞的上清液可以明顯刺激小管形成。1μmol芹菜素對A375黑色素瘤細胞誘導的小管形成具有抑制作用，2和4μmol濃度可以顯著抑制腫瘤細胞誘導的小管形成，并且具有一定的濃度依賴性（見圖4）。本實驗得出結(jié)論，芹菜素能抑制A375黑色素瘤細胞誘導的小管形成。

圖4　芹菜素對腫瘤細胞誘導的小管形成的影響

2.5芹菜素能抑制VEGF、MMP-9、p-P38及p-Erk蛋白的表達

Western blot檢測考察A375細胞中調(diào)控腫瘤細胞增殖及血管生成相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芹菜素能顯著降低VEGF、MMP-9、p-P38及p-Erk蛋白的表達，且具有濃度依賴性，但對t-P38及t-Erk蛋白表達無明顯影響（見圖5）。本實驗得出結(jié)論，芹菜素能通過下調(diào)增殖及血管生成相關(guān)蛋白的表達，發(fā)揮抑制腫瘤增殖及血管生成的作用。

圖5　芹菜素對A375腫瘤細胞調(diào)控增殖及血管生成相關(guān)蛋白表達的影響

3　討論

大量研究表明，腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移與腫瘤血管生成密切相關(guān)[22-23]，腫瘤血管的新生不僅能夠為腫瘤細胞提供豐富的氧氣和營養(yǎng)，同時還能將腫瘤細胞代謝產(chǎn)生的廢物及時排出。芹菜是日常生活中經(jīng)常食用的蔬菜之一。研究發(fā)現(xiàn)，芹菜的主要有效成分為芹菜素，而芹菜素具有多種藥理作用。筆者研究的興趣在于，對于經(jīng)常食用芹菜的腫瘤患者來說，芹菜對其病情的進展究竟有何種作用。據(jù)此，本實驗考察芹菜素對黑色素瘤相關(guān)生物學行為的影響，如增殖、遷移及血管生成等。同時本實驗也從分子層面對芹菜素影響黑色素瘤相關(guān)生物學行為進行研究。諸多研究證實Ras/Raf信號通路，尤其是其下游蛋白P38及Erk在調(diào)控腫瘤細胞增殖的過程中發(fā)揮的關(guān)鍵作用[24]，所以本實驗考察這兩種蛋白的表達以揭示芹菜素抑制黑色素瘤細胞增殖的可能機制。研究證實，VEGF是調(diào)控腫瘤血管生成最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子[25]，其水平的高低也反映血管生成的狀況，因此本實驗考察芹菜素對黑色素瘤細胞中VEGF蛋白的水平。MMP-9是調(diào)控腫瘤遷移及血管生成的重要因子之一，主要通過降解細胞外基質(zhì)進而促進腫瘤細胞的遷移[26]，因此本實驗也考察芹菜素對黑色素瘤細胞中MMP-9蛋白表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芹菜素能顯著抑制A375黑色素瘤的體外增殖、遷移及體內(nèi)腫瘤生長，同時芹菜素對A375黑色素瘤細胞誘導的血管生成具有明顯抑制作用。芹菜素可能通過抑制腫瘤的血管生成，發(fā)揮抑制腫瘤增殖及生長的作用。機制研究部分發(fā)現(xiàn)，芹菜素能顯著抑制Erk及P38蛋白表達，同時芹菜素對調(diào)控血管生成的VEGF及調(diào)控腫瘤細胞遷移的MMP-9蛋白具有顯著抑制作用。本文不足之處在于，只在細胞水平對相關(guān)蛋白進行考察，缺乏對體內(nèi)組織水平的蛋白考察，同時缺乏人黑色素瘤臨床樣本的相關(guān)研究，因此后期的研究重點會放在對黑色素瘤臨床樣本的考察上。

綜上所述，芹菜素能夠抑制A375黑色素瘤的生長、遷移及血管生成，芹菜素具有潛在臨床應用價值。

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（童穎丹編輯）

臨床論著

Effects of apigenin on growth, migration and angiogenesis of melanoma A375 cells and the mechanism

Hong-tao Xu1, Zhong-bao Han1, Hui-li Zhang1, Lin-wei Ma1, Min-chen Wang2
(1.Department of Clinical Medicine, Yancheng Institute of Health Sciences, Yancheng, Jiangsu 224005, China; 2.Department of Anatomy, Medical College, Soochow University, Suzhou, Jiangsu 215123, China)

Abstract:Objective To study the effects of apigenin on proliferation, migration and angiogenesis of human melanoma A375 cells and the mechanism of action.Methods The effects of apigenin on the proliferation of A375 cells were evaluated by the MTS method, and those on the in vivo growth of melanoma were assessed by establishing a subcutaneous xenograft model of nude mice.The influence of apigenin on in vitro cell migration was detected using the scratch assay, and that on the angiogenesis of human melanoma was detected by the tube formation assay.The regulatory effects of apigenin on the expressions of proliferationand angiogenesis-related proteins such as vascular endothelial growth factor (VEGF), matrix metalloproteinase-9 (MMP-9), phosphorylated p38 (p-p38), t-p38, phosphorylated ERK (p-ERK) and t-ERK were detected by Western blot.Results After in vitro treatment of A375 cells with apigenin, their in vitro proliferation and in vivo growth were significantly inhibited compared with those of the control group, and the migration capacity was also significantly lowered.Apigenin inhibited tumor cell-induced angiogenesis in the tube formation assay.Molecular mechanism study showed that apigenin inhibited the protein expressions of angiogenesis -related VEGF and MMP-9 as well as proliferation-related p-p38 and p-ERK.Conclusions Apigenin can inhibit thebook=1,ebook=52growth, migration and angiogenesis of melanoma A375 cells, probably by suppressing the expressions of proliferation- and angiogenesis-related proteins.

Keywords:apigenin; melanoma; proliferation; migration; tumor angiogensis; molecular mechanism

收稿日期：2015-09-09

文章編號：1005-8982（2016）01-0046-06

中圖分類號：R739.5

文獻標識碼：A