Micro RNA-132對結腸癌細胞生物學功能的作用

趙繼明，彭健（中南大學湘雅醫院，湖南長沙410008）

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Micro RNA-132對結腸癌細胞生物學功能的作用

趙繼明，彭健
（中南大學湘雅醫院，湖南長沙410008）

摘要：目的探討microRNA-132（miR-132）對結腸癌細胞系LOVO生物學功能的作用。方法通過體外轉染miR-132 mimic的方式進行獲得性功能實驗。以細胞計數檢測（CCK-8）、平板克隆形成、流式細胞凋亡檢測以及劃痕實驗分析miR-132過表達對LOVO細胞增殖與侵襲的影響。結果LOVO細胞中，外源性過表達miR-132能夠抑制其生長，且抑制率呈時間、濃度依賴性，50 nmol/L miR-132 mimic處理72 h后，抑制率達30％。流式細胞凋亡檢測發現miR-132過表達誘導細胞凋亡。miR-132過表達可以抑制LOVO細胞體內的外克隆形成能力。體外平板克隆形成實驗顯示，miR-132過表達使LOVO細胞克隆形成率從21％降至7％。劃痕修復實驗結果顯示，高表達miR-132各組細胞的遷移能力降低。結論miR-132過表達能顯著抑制結腸癌細胞LOVO發生細胞凋亡及增殖，還能削弱結腸癌細胞LOVO的克隆形成能力。

關鍵詞：microRNA-132；凋亡；增殖；遷移；克隆形成

MicroRNA-132（miR-132）是高度保守miRNA，其通過轉錄因子cAMP效應元件結合蛋白，從人類17號染色體上基因間隙區域轉錄而來[1]。大多數研究表明，miR-132的調節作用和生物學功能來源于神經元[2]。miR-132在炎癥、細胞轉化和腫瘤生成等病理過程中的作用也被學者們研究證實[3]。有研究指出，不同類型的人類癌癥中miR-132表達上調或下調[4]。但是，關于miR-132對結腸癌細胞生物學行為作用的系統研究較為少見。

由于不同結腸癌細胞內源性miR-132表達水平可能存在差異，為排除內源性miR-132對實驗的干擾，本研究采用熒光實時定量逆轉錄酶聯免疫反應檢測6株結腸癌細胞株（HCT116、HCT8、HT29、LS174T、LOVO及SW480）和HCo EpiC正常結腸細胞株中miR-132的表達。選取內源性miR-132表達水平最低的細胞株作為研究對象，將miR-132mimics轉染至該細胞株，建立miR-132過表達結腸癌細胞模型。檢測miR-132過表達對結腸癌細胞增殖、凋亡、細胞周期及遷移能力等生物學行為的影響，以期進一步了解miR-132在結腸癌發生、發展中的作用。

1　材料與方法

1.1實時定量聚合酶鏈反應

實時定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測結腸癌細胞株和正常結腸黏膜上皮細胞株中miR-132的表達。人結腸上皮細胞HCo EpiC、人結腸癌細胞系HCT116、HCT8、HT29、LS174T、LOVO及SW480購自中國科學院上海細胞庫，常規培養于含10％小牛血清的無血清細胞冷凍保存（dulbecco modified eagle medium，DMEM）高糖培基中。依照RNA提取試劑盒說明書提取HCT116、HCT8、HT29、LS174T、LOVO、SW480及HCoEpiC細胞中總RNA。紫外分光光度儀測定總RNA濃度與純度，A260/A280值為1.8～2.0，1％瓊脂糖凝獲電泳檢測質量。分別取HCT116、HCT8、HT29、LS174T、LOVO、SW480及HCo EpiC總RNA各1μg，逆轉錄酶混合液lμl，5×逆轉錄酶緩沖液4μl，加無RNA酶水至反應體積為20μl。37℃溫浴60 min，95℃、5 min，終止反應。2×PCR預混液25μl，10×通用引物5μl，10×特異引物Assay 5μl（hsa-miR-132引物序列代號為MS00004276，U6引物穿列代號為MS00007497，以U6為內參，德國Qiagen公司提供），cDNA模板2μl，加光RNA酶水定容至總反應體積50μl。反應條件：95℃預變性15 min，94℃變性15 s，55℃退火30 s，70℃延伸34 s，共8個循環。相同條件下實驗重復3次。

1.2實驗分組

由于miR-132在結腸癌LOVO細胞中的表達最低，因此本研究后續以LOVO細胞為研究對象來探討miR-132對結腸癌細胞生物學行為的作用。miR-132 mimics購自美國Ambion公司。轉染時細胞分為4組：①空白組，不作任何處理，繼續常規培養；②陰性對照組，轉染時加入無關序列Scramble mimics+脂質體2000；③實驗組，轉染時加入miR-132 mimics+脂質體2000；④羧基熒光素（Carboxyfluorescein，FAM）對照組，轉染時加入FAM-mimics control，該組用來檢測轉染效率，不再進行后續實驗。

1.3細胞克隆形成實驗

將空白組、陰性對照組及實驗組細胞培養至指數生長期，細胞懸液濃度調整為1×106個/ml，接種至雙瓊脂平板，待上層瓊脂凝固后，常規培養2周。將細胞培養皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細胞克隆數，計算形成率。克隆形成率=（克隆數/接種細胞數）×100％。

1.4細胞活力檢測

空白組、陰性對照組及實驗組細胞培養至指數生長期，以1 000個/孔的密度接種于96孔細胞培養板，設6個平行孔，每孔體積為0.2 ml。分別于1、2、3和4 d各取一塊96孔板培養板，超凈臺內棄去原培養液，加入按9∶1混合的培養液與細胞計數檢測（cell counting kit-8，CCK-8）反應液，96孔板繼續培養箱內孵育1 h后取出，輕輕震蕩10 min，用酶標儀于450 nm處檢測各孔吸光度值（optical delnsity，OD值），并按以下公式計算相對細胞增殖率：相對細胞增殖率（％）=（實驗孔平均OD值-空白調零平均OD值）/（對照孔平均OD值-空白調零平均OD值）×100％。實驗重復3次。

1.5流式細胞儀檢測

流式細胞儀檢測轉染miR-132 mimics對結腸癌LOVO細胞凋亡的影響。各組膜聯蛋白V-異硫氰酸酯（annexin V-fluoresceine isothiocyanate，Annexin V-FITC）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染，同時設置未染色空白對照管、單染Annexin VFTIC管及單染PI管。將環氧樹脂（epoxy epoxide，EP）管置于冰上，避光條件下室溫靜置10 min，加入400μl 1×Binding Buffer，輕輕混勻，并在30 min內進行檢測。以未染色空白細胞為基準調零機器，以Annexin V-FITC單染管和PI單染管做為基準參照，測定每個上樣EP管的數據。采用Cell Quest 3.0軟件進行參數獲取和資料分析，計算凋亡細胞百分比。

1.6劃痕修復實驗

劃痕修復實驗檢測miR-132 mimics對結腸癌LOVO細胞遷移能力的影響。取對數生長期的各組LOVO細胞，消化、計數，以5×105個/ml的密度接種于24孔板中，每孔500μl，培養4 h。待細胞貼壁后用小槍頭沿著每孔偏中線兩側劃痕，劃痕應較直且寬度一致，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffersaline，PBS）清洗1遍，確保清洗掉痕線上散在的細胞。每組設3個平行孔，加入含2％胎牛血清的DMEM培養液再放入培養箱內培養24、48和72 h，分別于每個時間點觀察細胞向中間的遷移情況，并在顯微鏡下拍照記錄。注意每次拍照的位置應固定，且每次拍照前用PBS洗2遍以去除漂浮的死細胞。計算閉合率以反映細胞的遷移能力，閉合率（％）=（遷移距離/劃痕距離）×100％。

1.7統計學方法

采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間樣本比較用Student’s t檢驗分析，P<0.05為差異統計學意義。

2　結果

2.1正常結腸細胞和結腸癌細胞中miR-132的表達

miR-132在結腸癌細胞中的表達與其在結腸癌組織中的表達基本一致，正常結腸細胞HCo EpiC中miR-132呈高表達，而6種結腸癌細胞株中miR-132表達被不同程度地抑制（見圖1）。其中LOVO細胞中內源性miR-132表達水平最低。

圖1　正常結腸細胞和結腸癌細胞中miR-132的表達（P=0.014）。見圖3。

2.2miR-132對LOVO細胞克隆形成的作用

用miR-132 imimics（實驗組）轉染LOVO細胞，使其過表達miR-132，與陰性對照組（Scramble mimics組）和空白組比較，實驗組克隆數明顯下降，差異有統計學意義（P=0.032），而陰性對照組和空白組的克隆數比較差異無統計學意義。見圖2。

圖2　3組克隆數比較

2.3MiR-132對LOVO細胞增殖能力的作用

本實驗采用CCK-8法繪制LOVO細胞系生長曲線，結果顯示，LOVO細胞轉染miR-132 mimics 72 h后，細胞增殖能力逐漸下降。實驗組細胞72、96 和120 h增殖能力明顯低于陰性對照組和空白組

圖3　miR-132 mimics對LOVO細胞生長能力的抑制作用

2.4miR-132對LOVO細胞凋亡的作用

流式細胞儀檢測細胞凋亡，結果顯示，空白組、陰性對照組及實驗組的凋亡率分別為（2.94±0.81）％、（3.02±1.12）％和（15.04±1.52）％。空白組與陰性對照組比較，差異無統計學意義（P=0.684）；實驗組和空白組比較，差異有統計學意義（P=0.003）。提示miR-132可促進LOVO細胞凋亡。見圖4。

2.5miR-132對結腸癌LOVO細胞遷移能力的作用

分別于24、48和72 h觀察各組細胞的劃痕修復。實驗組LOVO細胞遷移能力被抑制，48 h后各組遷移能力明顯受到抑制，差異有統計學意義（P= 0.037）。見附表。

圖4　流式細胞術檢測3組細胞的凋亡率

附表　3組細胞在不同時間的閉合率比較（％，±s）

附表　3組細胞在不同時間的閉合率比較（％，±s）

組別　24 h　48 h　72 h空白組　15.21±3.56　27.11±2.52　67.79±3.97陰性對照組　15.41±2.72　25.42±3.18　68.34±5.62實驗組　11.37±1.44　19.52±3.26　31.34±4.62

3　討論

miRNA是包含19～25個堿基的小分子非編碼RNAs，能夠通過與靶基因mRNAs的3’-非翻譯區（3’-untranslated regions，3’-UTRs）反應，反向調控靶基因表達。研究證實，miR-132具有調控多巴胺神經元分化，激活內皮細胞，發揮病理血管生成的作用[5]。還有研究表明，miR-132參與胰腺癌的發展過程[6]。

近年來，關于miR-132對腫瘤細胞生物學行為的作用的研究成果層出不窮，但是這些結果多有矛盾之處。You等[7]研究表明，miR-132在非小細胞肺癌和非小細胞肺癌組織標本中顯著下降，且恢復非小細胞肺癌細胞株中的表達，能夠抑制miR-132遷移和侵襲。Zhang[8]等研究發現，miR-132能夠抑制乳腺癌細胞的增殖、分化和轉移等。Luo等[9]研究發現，miR-132/212簇能顯著抑制肺癌細胞株H1299在裸鼠皮下的成瘤能力。而Park等[10]在胰腺癌中的研究發現，miR-132在胰腺癌組織中表達增加，抑制胰腺癌細胞株中miR-132表達導致胰腺癌細胞凋亡加快，侵襲和遷移能力顯著下降。本研究結果表明，恢復結腸癌細胞中MiR-132的表達，能顯著抑制結腸癌細胞惡性表型。MiR-132在不同腫瘤中發揮相反作用的原因目前仍不清楚，結合以往研究結果，本實驗推測其主要原因為：①腫瘤的異質性。不同腫瘤組織間的異質性，以及同類腫瘤組織中的異質性都可能導致miR-132作用的差異；②腫瘤來源不同，導致miR-132的作用也不盡相同。有的腫瘤源自內皮細胞，有的源自上皮細胞，而結腸癌細胞主要源自結腸星狀細胞；③不同腫瘤組織中靶基因表達豐度不同也導致miR-132作用差異。眾所周知，miRNA主要通過靶基因發揮作用，而且一種miRNA可能存在多種靶基因，而不同腫瘤組織中靶基因表達豐度不同，導致miR-132作用的靶基因也不一致，從而引起miR-132表達作用不同。

本研究發現，結腸癌LOVO細胞穩定過表達miR-132 mimics后，細胞增殖能力、體外細胞克隆形成率、抗凋亡能力、體內致瘤能力明顯下降，結果提示，結腸癌細胞的惡性表型與miR-132表達缺失有關。miR-132是結腸癌治療的潛在有效靶點。國內學者李書軍等[11]也做過類似的研究工作，探討miR-132對食管癌KYSE150細胞腫瘤調節因子FOXA1及mRNA表達的調節作用對食管癌KYSE150細胞增殖的影響，結果表明，過表達的miR-132能抑制KYSE150食管癌細胞增殖，該抑制作用至少部分與FOXA1基因的低表達有關。管娣等[12]試圖識別和發現腫瘤轉移相關miRNA，以期能夠作為治療靶點高效抑制腫瘤轉移，其為驗證miR-132與腫瘤遷移的相關性，將miR-132轉染入高遷移乳腺癌細胞系MDA-MB-231細胞中，檢測細胞遷移率的變化，結果發現miR-132能夠抑制MDA-MB-231細胞的遷移。管娣等[12]為進一步揭示miR-132抑制細胞遷移的可能機制，通過生物信息學手段尋找并鑒定3種可能與腫瘤轉移相關的miR-132的靶基因，其分別是STIP1同源性和含U框蛋白1（STIP1 homologous and U box containing protein1，STUB 1）、GTP酶激活蛋白-Src同源結構域3-結合蛋白1[GTPase activating protein-（Src homology domain 3）-bindingprotein 1, G3BP1]、GTP酶激活蛋白-Src同源結構域3-結合蛋白2[GTPase activating protein-（Src-homology domain 3)-binding protein 2, G3BP2]。管娣等[12]分別比較MCF7與MDA-MB-231細胞，以及轉染miR-132和陰性對照組MDA-MB-231細胞3種基因的表達差異，結果發現，G3BP1、G3BP2可能參與miR-132對腫瘤轉移的調控，與本研究結果類似。

總之，結合以往和本研究結果，miR-132有望成為結腸癌腫瘤基因治療的潛在高效靶點。

參考文獻：

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（童穎丹編輯）

Eeffect of miR-132 on biological characteristics of colon cancer cells

Ji-ming Zhao, Jian Peng
(Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Hunan 410008, China)

Abstract:Objective To investigate the effect of miR-132 on biological characteristics of conlon cancer LOVO cell line.Methods Synthetic miR-132 mimics and miRNAs cramble were transfected into LOVO cells using Lipofectamine 2000.Transwell assay was used to assess the effect of miR-132 on LOVO cell invasion and metastasis.CCK-8 assay was used to assess the effect of miR-132 on LOVO cell proliferation.Flow cytometry was used to assess the effect of miR-132 on LOVO apoptosis.Results Over-expression of miR-132 induced LOVO cell apoptosis, and subsequently inhibited LOVO cell growth and colony formation.Notably, 50 nmol/L miR-132 mimic demonstrated a potent inhibitory effect at 72 h after transfection and reduced cell viability by 30％.The colony formation ability was impared after miR-132 mimic treatment with a 14％ drop of in vitro colony formation rate.Also, miR-132 inhibited the LOVO cell migration.Conclusions miR-132 could suppress colon cancer cell growth through induction of cell apoptosis.

Keywords:miR-132; apoptosis; proliferation; migration; colony formation

[通信作者]彭健，E-mail：pengjian1698@aliyun.com

收稿日期：2015-10-16

文章編號：1005-8982（2016）01-0030-05

中圖分類號：R735.35

文獻標識碼：A