金胺“O”熒光染色LED顯微鏡檢測痰中抗酸桿菌的應用

毛小芳，楊敏，謝英，魏云爍(﹑峽江縣疾病預防控制中心檢驗科，江西峽江33409；﹑新余市婦幼保健院檢驗科，江西新余338000)

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金胺“O”熒光染色LED顯微鏡檢測痰中抗酸桿菌的應用

毛小芳1，楊敏2，謝英1，魏云爍1
(1﹑峽江縣疾病預防控制中心檢驗科，江西峽江331409；2﹑新余市婦幼保健院檢驗科，江西新余338000)

摘要：目的探討金胺“O”熒光染色LED顯微鏡法在檢測痰中抗酸桿菌的應用。方法依據《中國結核病防治規劃﹑痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》對2106例痰標本同時用萋-尼氏抗酸染色法和金胺“O”熒光染色法查找抗酸桿菌，比較兩種方法的實驗結果，分析金胺“O”熒光染色LED顯微鏡檢測抗酸桿菌的靈敏度和特異性。結果2106例痰標本中熒光染色陽性315例，陽性率15.0%；萋-尼氏染色陽性283例，陽性率13.4%，兩種方法符合率89.8%。對比兩組檢測結果，金胺“O”熒光染色LED顯微鏡法檢測的靈敏度和特異性均較高。結論金胺“O”熒光染色LED顯微鏡法是一種檢測靈敏度高﹑特異性好﹑操作簡便﹑快速的方法，對結核病患者的早期診斷和治療具有重要意義。

關鍵詞：熒光染色；LED顯微鏡；抗酸染色；結核病

中國是全球22個結核病高負擔國家之一，目前我國結核病年發病人數約為130萬，占全球發病人數的14%，位居全球第二位[1]。臨床上對于結核病的診斷多使用X線﹑病理切片﹑痰涂片鏡檢﹑痰培養等，但X線對無典型影像學表現患者有局限性，病理切片耗時長[2]。痰標本直接涂片法操作簡單﹑價格低廉，在我國廣泛用于肺結核病人的診斷。但傳統萋-尼氏抗酸染色法檢測時間長，陽性檢出率相對較低；金胺“O”熒光染色具有操作簡便﹑結果判讀方便等優點[3]。本次研究對2106例疑是結核病患者痰標本采用金胺“O”熒光染色LED顯微鏡和萋-尼氏抗酸染色兩種方法同時檢測痰標本中抗酸桿菌，進行比較，現將結果報告如下。

1　材料與方法

1.1標本來源2106例標本來源于2013年10月至2015年3月江西省峽江縣疾控中心結核病防治門診就診的疑是肺結核患者，包括初診患者和復治﹑隨訪患者。

1.2主要試劑及器材（由全球基金結核病項目提供）結核病熒光法染色液由珠海貝索生物技術有限公司生產，批號414041，有效期20160407。萋-尼氏染色液本實驗室按《中國結核病防治規劃﹑痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》[4]規定方法配制。寧波舜宇EX30LED熒光顯微鏡。奧林巴斯BA200Inf生物顯微鏡。青島海爾HR40-A2生物安全柜。帆船牌清潔﹑無油脂一端磨砂面的新玻片。1.3方法

1.3.1標本處理每份標本涂片2張，一張用于傳統萋-尼氏染色，一張用于金胺“O”熒光染色；挑取痰標本中呈膿樣﹑干酪樣可疑部分均勻涂抹成約2cm×1cm的卵圓形痰膜，盡量使2張痰片的取痰部位﹑痰膜厚度﹑痰膜大小基本一致；將涂好的痰片室溫下干燥后于5s內穿過酒精燈火焰上方4次將其固定。

1.3.2染色方法

1.3.2.1傳統萋-尼氏染色按《中國結核病防治規劃﹑痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》規定方法進行初染﹑脫色﹑復染[4]。

1.3.2.2熒光染色初染：將已固定的玻片置于染色架上，滴加0.1%的金胺O染色液覆滿玻片，放置15~20min；脫色：用自來水緩緩沖去初染液，滴加脫色液，脫色2min或至無色；復染：用自來水緩緩沖去脫色液，滴加0.5%高錳酸鉀復染液覆滿玻片1min，用自來水緩緩沖去復染液，將玻片瀝干水分，晾干。

1.3.3顯微鏡鏡檢萋-尼氏染色涂片用生物顯微鏡，用100×油鏡進行細致觀察，在藍色背景下抗酸桿菌呈紅色桿狀。熒光染色用LED熒光顯微鏡，40×物鏡觀察，在暗背景下抗酸桿菌發出黃綠色熒光，呈桿狀略彎曲。

1.3.4結果報告萋-尼氏染色鏡檢結果按《中國結核病防治規劃﹑痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》標準報告。熒光染色鏡檢結果報告標準：熒光抗酸桿菌陰性：0條/100視野；熒光抗酸桿菌陽性：1~9條/100視野；熒光抗酸桿菌陽性（1+）：10~49條/50視野；熒光抗酸桿菌陽性（2+）：1~9條/每視野；熒光抗酸桿菌陽性（3+）：10~99條/每視野；熒光抗酸桿菌陽性（4+）：>100條/每視野[4]。

2　結果

2013年10月至2015年3月本實驗室共收集痰標本2106例，傳統萋-尼氏染色法共檢出陽性283例，陽性率13.4%，其中<1+有36例，1+有160例，2+有45例，3+有23例，4+有19例；熒光染色法共檢出陽性315例，陽性率15.0%，其中<1+有55例，1+有173例，2+有45例，3+有23例，4+有19例。熒光染色法除與萋-尼氏法全部283例陽性結果完全相符外，另有32例標本萋-尼氏染色法檢測為陰性，熒光染色法檢測為陽性，此32例標本熒光染色法結果報告均為1+及<1+低含菌量標本。此32例含菌量低標本于檢測當日用離心集菌法涂片，重新用萋-尼氏法染色鏡檢，均報告為陽性，兩種方法檢測結果陽性總數差異無統計學意義（χ2=2.00，P＞0.05），<1+兩種方法檢測結果差異有統計學意義（χ2=4.05，0.01

表1　熒光染色法與萋-尼氏染色法檢測結果比較

3　討論

從本資料中可見，痰標本直接涂片查找抗酸桿菌時，熒光染色法的敏感度高于傳統萋-尼氏染色法。傳統萋-尼氏染色法是基層結核病實驗室發現涂陽肺結核病人的主要手段，該法只對少量的痰液進行檢查，只有當細菌達到較高濃度（10000 個/ml）時才能觀察到[5]，很大程度上限制了這種方法的檢測靈敏度。而熒光染色法鏡檢是在暗背景下抗酸桿菌發出藍綠色熒光，呈桿狀略彎曲，痰細胞及雜質不發光，萋-尼氏染色法鏡檢時在藍色痰細胞背景下找紅色桿狀菌，兩種方法相比較熒光染色法肉眼更容易發現抗酸桿菌[6]。本次實驗的2106例痰標本中32例低含菌量標本開始用萋-尼氏染色法檢測時為陰性而用熒光染色法檢測時為陽性，用離心集菌法重新對這32例痰標本涂片﹑染色﹑鏡檢，報告結果均為陽性。表明當痰標本含菌量較低時，熒光染色法鏡檢的敏感性優于傳統萋-尼氏染色法，而特異性無差異[7]。

熒光染色LED顯微鏡檢測法較傳統萋-尼氏染色法操作簡便。傳統萋-尼氏染色法操作繁瑣，技術要求較高，初染加熱時易產生氣溶膠，油鏡觀察視野范圍小，對陰性結果的判讀需選取300視野，鏡檢時間長，檢驗人員易疲勞，易漏檢低含菌量涂片[8]。熒光染色LED顯微鏡檢測法初染時不需加熱，減少了生物安全隱患，鏡檢采用40×的高倍鏡觀察，觀察視野范圍大，對陰性結果的判讀僅需選取100視野，顯著加快了鏡檢速度，判讀和報告結果變得簡單﹑快捷[9]。

綜上所述，金胺“O”熒光染色LED顯微鏡法檢測痰中的抗酸桿菌具有操作簡便﹑快捷﹑準確﹑可靠﹑靈敏度高，結果判讀方便等優點[10]，與傳統萋-尼氏染色法相比，能夠顯著提高低含菌量標本的檢出率，可在結核病患者的早期診斷和治療中推廣應用。

參考文獻

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[8]戴學海，金法祥，湯佳良，許鵬.金胺“O”熒光染色法在結核病細菌學檢驗中的應用[J].中國衛生檢驗雜志2008，18（5）：851，923.

[9]劉彬，陳小舟.熒光染色法檢測痰中結核桿菌的應用[J].醫學信息2013，26（3）：279.

[10]蘇新娣.金胺“O”熒光染色法對結核病細菌學檢驗的價值[J].中國醫藥指南2013，11（26）：365-366.

(收稿日期2015-05-25；修回日期2015-08-27)

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.01.030

中圖分類號：R378.91，R446.19

文獻標識碼：A

文章編號：1674-1129(2016)01-0082-02