基因組測序技術(shù)及其臨床應(yīng)用研究進展

梁振山綜述，曾令兵，萬臘根審校(1、南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西南昌0006；2、江西省兒童醫(yī)院檢驗科，江西南昌0006；、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西南昌0006)

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基因組測序技術(shù)及其臨床應(yīng)用研究進展

梁振山1，2綜述，曾令兵3，萬臘根3審校
(1、南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西南昌330006；2、江西省兒童醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006；3、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006)

摘要：目前，隨著全基因組測序技術(shù)的進一步發(fā)展，基因組測序技術(shù)在臨床與科研中越來越發(fā)揮著重要作用。近幾年來，基因組測序技術(shù)迅速發(fā)展，其在愈來愈受到學(xué)者們的關(guān)注。本文旨在對基因組及、基因組測序技術(shù)及其在臨床診斷中的應(yīng)用做一綜述。

關(guān)鍵詞：基因組；基因序列；基因測序技術(shù)

1　基因組及基因測序技術(shù)的進展

從分子生物學(xué)角度來講，雙鏈螺旋結(jié)構(gòu)的DNA分子控制每個生物個體的遺傳特性。基因組在生物學(xué)中的定義，是指包含該生物體中所有的DNA（有些病毒是RNA）中的全部遺傳信息，也即是一個生物體中完整的染色體DNA序列。顧名思義，微生物的基因組，即是指微生物染色體中的所有DNA序列。基因組學(xué)，也即是研究基因組構(gòu)成的一門學(xué)科，它興起于上世紀(jì)90年代初的人類基因組計劃。在人類基因組計劃實施的同時，人們也啟動了微生物的基因組研究計劃。1995年，F(xiàn)leischmann研究小組率先發(fā)布了第一株微生物的全基因圖譜。他們采用全基因組隨機測序法（即wholegenome shotgun sequencing，簡稱“鳥槍測序法”），對流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）的全基因組進行了較為全面的分析，獲得了第一株微生物的全基因組數(shù)據(jù)，這在細(xì)菌基因組測序的歷史上屬首次[1]。此后，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的臨床微生物（或者稱為病原微生物）、模式微生物、環(huán)境微生物、工業(yè)微生物等都被測序，并獲得全基因組數(shù)據(jù)[2-7]。近年來，完成的基因組（包括微生物基因組在內(nèi)）呈現(xiàn)幾何級數(shù)增長，這不僅為探索基因本質(zhì)提供了大量的數(shù)據(jù)，也為后基因組時代的到來奠定了堅實的基礎(chǔ)。

2　基因組測序技術(shù)的研究進展

Sanger測序是最早的基因測序技術(shù)，被稱為第一代測序技術(shù)，它是由Fredrick Sanger在1975年發(fā)明的。該測序方法又稱為“雙脫氧鏈終止法”[8]。其基本原理是在聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）的過程中，不斷地在引物的3’端加入dNTP，使得模板得以延伸，最終得到新的模板。一旦在合成模板鏈的過程中摻和進的是雙脫氧核苷酸（ddNTP）。由于ddNTP的3’端缺少羥基，無法再繼續(xù)延伸，因此PCR反應(yīng)至此位點終止。最終，PCR的產(chǎn)物將形成一系列由5’-3’ddNTP組成的、長短不一的DNA片段。采用變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離這些DNA片段。并借助放射自顯影技術(shù)檢測這些DNA片段，就可以獲得相應(yīng)的序列信息。除Sanger測序外，這個時期還出現(xiàn)了一系列其他的測序方法，如焦磷酸測序法（二代測序技術(shù)中被Roche公司所采用）、鏈接酶法等[9-11]。但是，他們的共同核心都是借助了Sanger的可中斷PCR反應(yīng)的ddNTP作為底物。

Sanger測序法的優(yōu)勢是其測序讀長能夠達(dá)到1，000bp，并且測序的準(zhǔn)確率高達(dá)99.999%。但是缺點是測序成本高、通量低，會嚴(yán)重影響全基因組測序的效率，非常有必要開發(fā)新的全基因組測序技術(shù)。

二代測序技術(shù)主要由Roche、Illumina和ABI三個公司主導(dǎo)分別推出了454、Solexa和Solid測序平臺。二代測序技術(shù)是在Sanger測序的基礎(chǔ)上進行改良[12]。首先進行預(yù)擴增：未標(biāo)記的dNTP和普通Taq酶進行固相橋式PCR擴增，單鏈待測片段通過PCR生成雙鏈片段。高溫變性后解鏈得到互補的單鏈，固定在附近的固相表面，經(jīng)過PCR循環(huán)后，可以得到大量的待測序單鏈片段。常用的固相有磁珠，帶有待測片段的磁珠在PTP的平板上反應(yīng)，PTP平板上有許多孔，每個孔只能容下單個磁珠反應(yīng)，然后在反應(yīng)環(huán)境中加入四種不同顏色熒光標(biāo)記的dNTP以及聚合酶進行PCR擴增，通過捕捉四種不同熒光信號，換算成信號峰值強度，再通過計算機軟件計算測序數(shù)值。相對于Sanger測序，二代測序技術(shù)最大的特點是實現(xiàn)了高通量，同時高通量測序一次可以讀取10~100萬條序列。在很大程度上降低了測序的成本，獲得大規(guī)模的基因組數(shù)據(jù)就成為了可能。但是，二代測序技術(shù)也存在較多的缺陷，其最大的一個不足就是測序片段較短，從而會對全基因組的后續(xù)分析造成較大的困難，導(dǎo)致測序之后出現(xiàn)較多的contigs，很難在短時間內(nèi)拼接完成。對于一些GC含量較為極端的物種，就會出現(xiàn)大量contigs，導(dǎo)致難以拼接至染色體上，進而嚴(yán)重影響測序的進度。而解決這種困難的途徑，就需要構(gòu)建一系列的DNA文庫，進行重測序工作，這同時也增大了工作量。見表1。

近兩三年以來，基因組測序技術(shù)取得了非常大的進步。其中以PacificBio公司的SMRT和OxfordNanopore technologies的納米孔技術(shù)最為突出，也被稱之為第三代測序技術(shù)[13，14]。第三代測序技術(shù)又稱之為“單分子測序技術(shù)”，與二代測序技術(shù)相比，其不需要經(jīng)過PCR擴增，并且可以實現(xiàn)超長讀長。第三代基因組測序的基本原理是：基因組模板與DNA聚合酶結(jié)合之后，標(biāo)有4種不同顏色熒光的dNTP，在堿基配對階段不斷地加入，檢測器可以通過檢測不同的熒光來判斷堿基序列。而與基因組模板結(jié)合的DNA聚合酶是實現(xiàn)三代測序超長讀長的重要因素之一。DNA聚合酶的活性直接影響到最終測序的讀長。而聚合酶的活性受到眾多因素的影響，包括測序前樣本的處理（其中是否含有酶的螯合劑、蛋白、RNA等）、上機測試是激光對酶活性的影響等等。因此，第三代測序技術(shù)對于基因組樣本質(zhì)量要求較高。在基因組樣本制備的過程中，不能含有過高的蛋白，同時也不能含有聚合酶的抑制劑等污染物。通常，三代測序前都需要對基因組樣本質(zhì)量進行測定，以確保后續(xù)實驗?zāi)軌蝽樌剡M行。第三代測序技術(shù)最大的優(yōu)勢，在于其超長的讀長（有時可以超過3，000bp），但是其最大的缺陷是測序的錯誤率較高。測序速度較快的SMRT技術(shù)的錯誤率可以達(dá)到15%，但好在錯誤率的出現(xiàn)是隨機性的，并不像二代測序技術(shù)具有偏向性。

綜上所述，每一種全基因組測序技術(shù)都有其優(yōu)勢及缺陷。當(dāng)今，為了快速而準(zhǔn)確地獲得全基因組數(shù)據(jù)，我們就需要結(jié)合不同的測序方法，發(fā)揮各種測序技術(shù)的優(yōu)勢，規(guī)避劣勢；從而能夠準(zhǔn)確而快速的完成測序工作。

表1　各種二代測序方法及平臺的比較

3　基因組測序技術(shù)在臨床中的應(yīng)用

3.1臨床微生物診斷以及微生物耐藥監(jiān)測傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)加藥敏通常需耗時一周左右，基因組測序可以在短時間內(nèi)完成微生物的鑒定及藥敏，為臨床及時提供用藥指導(dǎo)，另外還可以克服藥敏鑒定儀種數(shù)據(jù)庫不完整和過時的缺點，避免誤診。

此外，基因組測序技術(shù)還可以為臨床微生物提供可靠的流行病學(xué)資料，對于醫(yī)院院內(nèi)感染的控制和預(yù)防具有非常重要的作用。2012年，在The New England Journal of Medicine上發(fā)表了一篇關(guān)于新生兒感染MRSA（耐甲氧西林金黃色葡萄球菌）的全基因組報道[3]。

基因組測序技術(shù)不僅可以運用在臨床微生物的鑒定，同時也可以用于臨床微生物的藥敏結(jié)果檢測。例如多重耐藥的肺結(jié)核（簡稱“MTB”）和人類免疫缺陷病毒（簡稱“HIV”）的藥敏檢測，已經(jīng)能夠通過基因組測序技術(shù)進行快速、準(zhǔn)確地檢測。2013年，Jacqueline等在New England Journal發(fā)表了通過全基因組測序的方法，鑒定多重耐藥肺結(jié)核分枝桿菌的耐藥情況[15]。他們完成全基因組測序之后，發(fā)現(xiàn)分離得到的肺結(jié)核分枝桿菌基因組中共包含了39個耐藥基因，而標(biāo)準(zhǔn)化實驗室只報道了對其中的9種藥物耐藥。后期的表型實驗證實，該株肺結(jié)核分枝桿菌對amikacin，capreomycin，clofazimine和linezolid敏感。基因組數(shù)據(jù)與這一表型完全符合。此外，通過基因組測序，該研究小組還在amithiozone，gatifloxacin，levofloxacin，rifapentine 和rifabutin的作用位點中發(fā)現(xiàn)了突變，而這幾類藥物并沒有包含在標(biāo)準(zhǔn)化實驗室的報告中。因此，借助基因組測序技術(shù)，可以更加完整、快速、準(zhǔn)確地了解臨床微生物的耐藥情況，為臨床治療選擇合適的藥物提供重要的支持[16]，很多報道將全基因組測序技術(shù)運用到臨床微生物的診斷[3，4，7，17，18]，為臨床微生物的診斷和治療提供重要依據(jù)。

3.2基因組測序技術(shù)在遺傳病和產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用。染色體異常檢測[19-21]：在基因測序出現(xiàn)之前，臨床上針對遺傳病主要是染色體培養(yǎng)，鏡檢染色帶型來診斷。染色體培養(yǎng)耗時長，效率低，檢測范圍有限。在測序技術(shù)出現(xiàn)后，2007年Korbel[22]等提出一種新的高通量分析方法，基因組配對對比法，首先將染色體打碎成基因片段，PCR擴增后進行基因組測序，得到整個基因組圖譜后與人類基因組參考圖片配對比對，可發(fā)現(xiàn)例如倒置，方向錯誤，序列長度不等等1000多個結(jié)構(gòu)變異。在臨床中，染色體結(jié)構(gòu)變異的常見類型有缺失、重復(fù)、倒位和易位4種，如貓叫綜合征，女性習(xí)慣性流產(chǎn)，可以導(dǎo)致慢性粒細(xì)胞白血病等；同時在臨床中還有許多遺傳病是因為基因點突變導(dǎo)致的。而通過傳統(tǒng)遺傳學(xué)染色異常來診斷是很受限制的，例如β－地中海貧血，其基因含1個41~42位點突變基因雜合子，傳統(tǒng)遺傳學(xué)方法敏感性很低，但是通過高通量測序則可以逐一檢測出異常位點，及時做出準(zhǔn)確的診斷。畸形胎兒一直困擾廣大孕婦和醫(yī)生，雖然可以通過臍帶血或者羊水的染色體帶型來診斷一部分，但是這種傳統(tǒng)方法非常局限，而且具有較大風(fēng)險，采用新一代高通量基因測序技術(shù)的基因芯片可準(zhǔn)確檢測胎兒遺傳異常。翁惠男，梁嘉穎等[23]回顧了1800多例孕期12周以上的孕婦，發(fā)現(xiàn)無創(chuàng)產(chǎn)前基因測序高危孕婦，再通過臍帶血或者羊水細(xì)胞培養(yǎng)染色體分型(21－三體綜合征、18－三體綜合征、13－三體綜合征）。發(fā)現(xiàn)21－三體綜合征的敏感性為100%，準(zhǔn)確性為92.9%。18－三體綜合征和13－三體綜合征的敏感性及準(zhǔn)確性均為100%。無創(chuàng)產(chǎn)前胎兒基因檢測可提高產(chǎn)前診斷效率，其敏感性準(zhǔn)確性與染色體帶型分析技術(shù)高度一致，可減少畸形胎兒的出生，且安全，較介入性產(chǎn)前診斷易于接受，具有較高的臨床實際應(yīng)用價值[24]。

3.3基因測序技術(shù)與個性化醫(yī)療。個性化醫(yī)療即指精準(zhǔn)醫(yī)療—基于個人基因組信息，為患者量身制定治療方案，是讓效果最大化而副作用最小化的最佳選擇。1.藥物基因組學(xué)，根據(jù)基因組來選擇最佳藥物種類和劑量，在保證安全的前提下達(dá)到最佳治療效果[25-28]。范宇飛等[29]，對25例腫瘤患者進行基因檢測，執(zhí)行個體化醫(yī)療，對比對照組發(fā)現(xiàn)實施個體化治可提高有效率，延長患者生存期。2.腫瘤及腫瘤遺傳學(xué)，目前對腫瘤的診斷，治療效果評價以及預(yù)后檢測都是通過測定血清中腫瘤標(biāo)志物[21]。包括甲胎蛋白、癌胚抗原、同工酶、激素(人絨毛膜促性腺激素)、組織特異性抗原(前列腺特異性抗原、游離前列腺特異抗原)、黏蛋白、糖蛋白、糖脂(CAl25)的等。然而最新的基因測序技術(shù)可以捕獲腫瘤基因[30]，及時做出診斷，甚至預(yù)判腫瘤的發(fā)生，及時作出預(yù)防和早期干預(yù)。好萊塢知名女星安吉麗娜?朱莉通過測序技術(shù)確定帶有乳腺癌基因1號（BRCA1號）基因[21，32]，估測分別有87%和50%的概率患上乳腺癌和卵巢癌，結(jié)合她母親50歲左右因乳腺癌去世的家族病史，她接受了預(yù)防性的切除術(shù)以降低罹癌風(fēng)險。基于基因測序技術(shù)的個性化醫(yī)療可精準(zhǔn)診斷，降低分險，提供更加安全高效的治療方案。

4　展望

隨著全基因組測序技術(shù)的進一步發(fā)展，測序成本的進一步降低，將全基因組測序引入臨床診斷也將逐漸成為現(xiàn)實。一方面，不僅可以快速地診斷出一些常見及不常見的疾病；還可以預(yù)測許多疾病，通過早期干預(yù)和預(yù)防，降低發(fā)病率。另一方面，隨著技術(shù)的愈發(fā)成熟，測序技術(shù)從實驗室慢慢走向臨床，風(fēng)靡全球，市場潛力巨大，但是政府部門卻缺少有效監(jiān)管和測序?qū)嶒炇业臏?zhǔn)入制度，甚至沒有質(zhì)量控制體系，2014年2月9號，中國國家食品藥品監(jiān)管總局、國家衛(wèi)生與計劃生育委員會聯(lián)合發(fā)布(25號文件)“臨床使用基因測序相關(guān)產(chǎn)品和技術(shù)管理的通知”，要求停止一切商用基因測序產(chǎn)品[33]。近期，政府已出臺基因測序相關(guān)政策，未來在政府有效監(jiān)管和質(zhì)量監(jiān)控、技術(shù)準(zhǔn)入制度的進一步完善下，基因測序技術(shù)會飛速發(fā)展，為臨床提供不可限量的幫助。

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·講座·

(收稿日期2015-11-30；修回日期2016-01-10)

通信作者：萬臘根，男，1964年12月生，主任技師，研究方向：從事臨床檢驗診斷及分子生物學(xué)，郵箱：wlgme196412@126.com

作者簡介：梁振山，男，1984年8月生，在讀碩士研究生，檢驗師，研究方向：從事臨床檢驗診斷及分子生物學(xué)。

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.01.016

中圖分類號：R446.62，Q751

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1674-1129(2016)01-0048-04