重度子癇前期患者外周血Th17和Treg細胞變化及意義

夏良萍，蔡琴，張曉鳳(江蘇大學附屬第四人民醫院檢驗科，江蘇鎮江212001)

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重度子癇前期患者外周血Th17和Treg細胞變化及意義

夏良萍，蔡琴，張曉鳳
(江蘇大學附屬第四人民醫院檢驗科，江蘇鎮江212001)

摘要：目的探討重度子癇前期（sPE）患者外周血Th17及CD4+CD25+Treg細胞變化及意義。方法選取2011-2013年鎮江婦幼保健院40例sPE患者及40名健康對照者。采用流式細胞術檢測外周血單個核細胞中Th17及CD4+CD25+Treg細胞水平；采用ELISA檢測血漿IL-17、IL-22、TGF-β和IL-10水平，并分析其與sPE的相關性。結果sPE患者組外周血Th17細胞水平為(1.21±0.82)%，顯著高于健康對照組的(0.74±0.63)%，差異有統計學意義(t=3.45，P=0.002)。sPE患者組外周血CD4+CD25+Treg細胞水平為(1.65±0.49)%，顯著低于健康對照組的(2.42±0.91)%，差異有統計學意義（t=-4.25，P=0.001）。sPE患者組IL-17、IL-22水平分別為80.03±31.25、60.22±18.32ng/L，高于健康對照組的32.84±17.23、35.24±14.33ng/L，差異有統計學意義（t值分別為10.74、5.89，P均＜0.01），IL-10、TGF-β水平為26.29±10.31、25.65±11.81ng/L，低于健康對照組的33.24±11.93、48.261±13.85ng/L，差異有統計學意義(t值分別為3.35、6.78，P均＜0.01)。sPE患者血漿IL-17、IL-22水平與Th17細胞水平呈顯著正相關(r=0.69、0.58，P＜0.01)。結論sPE患者Th17細胞數量增高，CD4+CD25+Treg細胞數量減少，以及相關細胞因子的紊亂在sPE的發病機制中可能起到重要作用。

關鍵詞：重度子癇前期；T淋巴細胞；細胞因子類

重度子癇前期（server pre-eclampsia，sPE）是危害嚴重的妊娠期特有疾病，是導致孕產婦及圍產兒患病和死亡的重要原因。Th17和調節性T細胞（regulatory T cells，Treg）細胞是近年新發現的兩個不同于Th1和Th2的Th細胞亞群。Th17主要分泌IL17、IL22等促炎癥因子，在自身免疫中起重要的作用。Th17細胞在胚胎免疫排斥的發生中起一定作用[1]；而Treg細胞是一個可誘導免疫耐受并且有獨特免疫調節功能的T細胞亞群，有助于母體對胎兒耐受[2]。本研究通過測定sPE患者外周血中Th17、CD4+CD25+Treg細胞水平及相關細胞因子表達，探討其在sPE發病機制中的作用。

1　材料與方法

1.1研究對象選擇2011年6月至2013年12月在鎮江市婦幼保健院婦產科剖宮產分娩的sPE患者40例為研究對象，40例正常妊娠產婦為對照組。所有入組孕婦孕前均無高血壓、腫瘤、內分泌等疾病，肝腎功能無異常。兩組孕婦年齡、體重指數等比較，差異均無統計學意義(P>0．05)。sPE診斷標準參照樂杰主編的全國統編教材《婦產科學》第7版。

1.2標本采集采集sPE患者及正常產婦外周全血4ml，肝素抗凝。及時分離血清-70℃保存。

1.3試劑和儀器⑴Thl7流式檢測試劑盒和CD4+CD25+Foxp3+Treg流式檢測試劑盒購自Biolegend公司；佛波酯、離子霉素均購自Sigma公司；莫能霉素購自Biolegend公司；流式細胞儀型號為FACSCalibur（美國BD公司)。⑵細胞因子檢測：ELISA試劑盒購自美國R&D公司；Bio-Rad imark酶標儀(美國Bio-Rad)。

1.4 Th17細胞的檢測用Ficoll法分離出PBMC，用RPMll640重懸提取的PBMC；取20μl細胞懸液加20μl錐蟲藍，調節細胞濃度為2×106/ml；加入PMA和離子霉素后充分混勻，放入CO2細胞培養箱中培養1h后加入莫能霉素，混勻后培養5h。取培養后細胞懸液100μl于流式管中，每管加0.5ml固定液，搖勻室溫孵育20min；加入2m l破膜洗液，混勻室溫孵育20min后離心棄上清；用破膜洗液洗滌和重懸，加入10μl抗人IL-17Alexa Fluor647/ CD3 FITC/CD4 PE抗體混勻，室溫孵育30min，30min內上流式細胞儀檢測。

1.5 CD4+CD25+Treg細胞的檢測取20μl細胞懸液加20μl錐蟲藍；加入1mlFOXP3透膜液，混勻后室溫孵育20min；洗滌重懸細胞，室溫孵育15min；加入10μl抗人FOXP3 Alexa Fluor488/CD25PE/ CD4 PerCP抗體后暗處孵育30min；30min內上流式細胞儀檢測。

1.6外周血血漿IL-17、IL-22、IL-10、TGF-β檢測采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA），操作步驟按照ELISA試劑盒說明。

1.7統計學分析采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。計量資料以均值±標準差（±s）表示，定量資料比較采用兩獨立樣本t檢驗，相關性分析采用Pearson相關分析法。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1 sPE患者外周血Th17細胞和CD4+CD25+Treg細胞水平sPE患者外周血Th17細胞水平為（1.21±0.82）%，高于健康對照組的（0.74±0.63）%，差異有統計學意義（t=3.45，P=0.002）；sPE患者外周血CD4+CD25+Treg細胞水平為（1.65±0.49）%，低于健康對照組的（2.42±0.91）%，差異有統計學意義（t=-4.25，P=0.001）。

2.2細胞因子檢測結果sPE患者外周血IL-17、IL-22表達水平明顯高于健康對照組，差異有統計學意義；sPE患者IL-10、TGF-β表達水平明顯低于健康對照組，差異有統計學意義。見表1。

表1　重度子癇前期患者血漿中細胞因子的表達水平（n g/L，±s）

表1　重度子癇前期患者血漿中細胞因子的表達水平（n g/L，±s）

組別IL-17 （ng/L) IL-22 （ng/L) IL-10 （ng/L) TGF-β （ng/L)重度子癇前期組健康對照組t值P值例數4 0 40 80.03±31.25 32.84±17.23 10.74 <0.01 60.22±18.32 35.24±14.33 5.89 <0.01 26.29±10.31 33.24±11.93 3.35 <0.01 25.65±11.81 48.261±13.85 6.78 <0.01

2.3相關性分析sPE患者血漿IL-17、IL-22水平與Th17細胞水平呈顯著正相關（r=0.69、0.58，P< 0.01）；IL-10、TGF-β與CD4+CD25+Treg細胞呈正相關（r=0.58、0.60，P<0.01）。

3　討論

Th17細胞分泌高水平的IL-17、IL-22、IL-23，并高表達轉錄因子RORγt，Th17細胞在自身免疫性疾病中的研究證實其參與人體免疫及炎癥反應的生物學過程[3，4]。Brewster等[5]研究表明，sPE患者血漿中IL-17水平顯著高于正常妊娠組。有學者發現IL-17等Th17細胞系列細胞因子與胎膜早破、宮內感染等臨床表現有密切關系[6]。本研究發現sPE患者外周血Th17細胞高于正常妊娠組，同時發現sPE患者外周血Th17細胞產生炎性因子IL-17、IL-22高于對照組。進一步證明Th17細胞在sPE發病機制中發揮一定的作用。Th17細胞分泌高水平的IL-17介導sPE的可能機制是：高水平IL-17與多種細胞因子協同作用，可促進胎盤小血管炎癥反應。同時IL-17有募集中性粒細胞的能力，粒細胞釋放的活性物質可造成內皮細胞損害，這可能是構成了患者血管痙攣、血壓升高、蛋白尿、水腫等臨床表現的病理基礎。

Treg細胞是一類控制體內自身免疫反應性的T細胞亞群，以表達轉錄抑制基因Foxp3為特征并分泌IL-10、TGF-β，可誘導免疫耐受并具有獨特免疫調節功能的T細胞亞群[7，8]。近年來有研究證實sPE患者外周血中Treg細胞數量與正常妊娠組相比明顯減少[9]。本研究發現sPE患者外周血Treg細胞低于正常妊娠組，與先前的報道相符。Treg細胞是維持人體自身免疫耐受的一組細胞群，Treg細胞活化后能抑制自身免疫反應性，能維持正常妊娠的免疫平衡，Treg細胞在胚胎著床及妊娠過程中起著至關重要的作用[10]。轉錄抑制基因Foxp3表達下降可能是影響Treg細胞增殖分化、細胞減少的因素之一，導致Treg細胞和效應性T、B淋巴細胞之間的失衡，最終引發病理妊娠。細胞因子TGF-β具有雙向調節T淋巴細胞作用，低濃度的TGF-β可誘導RORγt表達水平升高，從而促進Th17細胞分化；而高濃度TGF-β能抑制IL-17的表達而增強Foxp3表達，進而促進Treg細胞增殖分化[11~13]。本研究發現sPE患者TGF-β水平明顯降低，可能是TGF-β的降低導致Treg細胞減少，Th17細胞增加，使sPE患者免疫失衡，導致患者疾病的發生。

妊娠是全身各系統參與的過程，胎兒與母體間的免疫平衡決定了妊娠的成敗，當免疫平衡失調，可導致病理性妊娠或妊娠失敗[14]。隨著新的CD4+T細胞的發現，現將傳統的妊娠免疫理論模式發展為Th1/Th2/Treg/Th17模式[15]。研究Th17、Treg細胞在sPE發病機制中的作用為臨床預測和治療該疾病，尋找到治療sPE等妊娠合并癥的新靶點提供了一個新的思路。

參考文獻

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·讀者·作者·編者·

The imbalance of Th17 and Treg cells in patientsw ith severe pre-eclampsia

XIA Liangping，CAIQin，ZHANG Xiaofeng.Department of Clinical Laboratory，the Fourth Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China.

Abstract：Objective To analyze the levels of Th17 and CD4+CD25+Treg cells in peripheral blood of patientswith sPE.M ethods The percentage of Th17 and CD4+CD25+Treg cells in peripheral blood were examined by flow cytometry.Plasma cytokines levelsweremeasured by ELISA.Results The percentage of Th17 cells in patientswith sPE was higher than that of healthy controls[(1.21±0.82)%vs(0.74±0.63)%，t=3.447，P=0.002].The percentage of CD4+CD25+Treg cells in patientswith sPE was lower than that of healthy controls[(1.65±0.49)%vs(2.42±0.91)%，t=-4.25，P=0.001].Plasma levels of IL-17，IL-22 in sPE patients were 80.03±31.25、60.22±18.32ng/L，and in the control group were 32.84±17.23、35.24±14.33ng/L，respectively，they were significantly differentbetween the two groups(t=10.74、5.89，all P<0.01).However，IL-10 and TGF-βlevelsweremarkedly decreased in sPE patients compared with controls(26.29±10.31、25.65±11.81ng/L vs 33.24±11.93、48.261±13.85ng/L，t=-3.35、6.78，all P<0. 01).IL-17、IL-21 had positive correlation with Th17 cells(r=0.69、0.58，respectively，all P<0.01)in sPE patients.Conclusion This study suggests that the imbalance of Th17 cells and CD4+CD25+Treg cells，the disorder of related cytokines are important in the pathogenesis of sPE.

Key words：Severe pre-eclampsia；T-Lymphocytes；Cytokines

(收稿日期2015-11-03；修回日期2015-12-16)

作者簡介：夏良萍，女，1977年3月出生，學士學位，檢驗主管技師，檢驗專業，主要研究方向：流式細胞術。

基金項目：江蘇省衛生廳科研基金資助項目（H201249）

中圖分類號：R446.62，R714.24+5

文獻標識碼：A

文章編號：1674-1129(2016)01-0018-03

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.01.006