漿液性和黏液性卵巢囊腺癌患者線粒體結構和緊密連接蛋白表達的差異比較*

譚樹芬　楊宏英　張　芍　祝英杰

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漿液性和黏液性卵巢囊腺癌患者線粒體結構和緊密連接蛋白表達的差異比較*

譚樹芬楊宏英張芍祝英杰

【摘要】目的：探討漿液性卵巢囊腺癌(SC)與黏液性卵巢囊腺癌(MC)細胞線粒體結構及緊密連接(TJ)蛋白occludin/ZO-1表達異常的差異及可能機制。方法：臨床確診30例卵巢囊腺癌患者中15例為SC(SC組)，15例為MC(MC組)，另選3例子宮肌瘤患者進行對照(對照組)。采用電鏡觀察各組線粒體超微結構；采用體視學方法分析線粒體面數密度(Nm)、體密度(Vvm)和外膜面密度(Sv)；采用免疫組化方法檢測各組卵巢上皮細胞occludin/ZO-1蛋白的陽性單位(PU)及其強弱程度(用積分光密度值IOD表示)。結果：電鏡下，對照組線粒體及內質網均未見異常；MC組線粒體體積小、數量較多，線粒體Nm、Vvm 和Sv較對照組明顯降低(P<0.05)；SC組線粒體體積大，脊斷裂顯著，線粒體Nm、Vvm和Sv較MC組顯著升高(P<0.01)。免疫組化分析顯示MC組occludin和ZO-1 PU明顯高于對照組(24.23±4.74 Vs 21.07±5.51、37.07±3.58 Vs 20.46±4.89，P均<0.05)，IOD明顯低于對照組(72.39±9.86 Vs 92.38±7.17、73.51±6.86 Vs 80.34±7.04，P均<0.05)；SC組occludin和ZO-1 PU明顯低于對照組(11.50±4.15 Vs 21.07±5.51、16.24±3.61 Vs 20.46 ±4.89，P均 <0.05)，IOD明顯高于對照組(101.38±6.16 Vs 92.38±7.1、92.78±3.07 Vs 80.34±7.04，P均 <0.01)。結論：SC及MC兩種卵巢囊腺癌患者線粒體結構和體視學特征明顯不同，可能與TJ蛋白的occludin/ZO-1表達異常有關。

【關鍵詞】漿液性卵巢囊腺癌；黏液性卵巢囊腺癌；線粒體超微結構；體視學；緊密連接蛋白

卵巢癌是女性最常見腫瘤之一，約占卵巢惡性上皮腫瘤的90%。腫瘤轉移是惡性腫瘤的重要生物學特性，是一個多步驟、多因素參與的復雜過程，通常不易被發現，且預后差[1,2]。近年研究顯示,緊密連接(Tight Junction,TJ)蛋白是腫瘤細胞黏附、趨化、侵襲及轉移的重要物質，主要由跨膜蛋白(occludin)和胞漿附著蛋白(ZO-1)以及細胞骨架蛋白組成，Zhu等[3]研究認為occludin對維持TJ蛋白功能具有重要作用；我們的前期研究[4]發現漿液性卵巢囊腺癌(Serous Ovarian Cystadenocarcinomamucinous,SC)和黏液性卵巢囊腺癌(Mucinous Ovarian Cystadenocarcinoma,MC) 細胞線粒體結構改變明顯不同，但這種差異是否與TJ表達異常有關尚不明確。本研究通過體視學原理分析兩種腫瘤細胞線粒體三維結構[5]，并采用免疫組化方法檢測TJ蛋白occludin/ZO-1的表達變化，比較SC和MC細胞線粒體結構差異及其與occludin/ZO-1表達異常的可能關聯，為兩種卵巢癌的臨床早期診斷尋找新的線索。

1資料與方法

1.1病例和分組

2011-01—2013-12，30例卵巢癌患者在本院行卵巢癌切除術，年齡30-70歲；診斷符合病理學標準，經免疫組化染色確認15例為SC(SC組)，另15例為MC(MC組)；再選3例子宮肌瘤患者作為對照組。

1.2主要試劑和儀器

occludin/ZO-1一抗(鼠抗人抗體)、二抗(抗鼠/兔聚合物)及DAB顯色劑(DAB-0031)均購于福州邁新生物技術開發有限公司，蘇木素(Hematoxylin)由英國進口分裝。超薄切片機(Leica RM2135， 德國)； 日立JEM-1011型電子顯微鏡(日本)；HPIA-2000高清晰度病理圖文分析系統(同濟大學)；顯微攝影系統(Leica DM4000B，德國)；顯微鏡攝影軟件(Leica IM50，德國)；顯微圖像分析系統(Nikon-MiVnt，日本)。

1.3線粒體電鏡觀察及體視學分析

1.3.1電鏡觀察：取各組卵巢組織塊，3.5%戊二醛固定，磷酸鹽緩沖液沖洗后，丙酮酸逐級脫水，1%四氧餓酸再固定24h，超薄切片機半薄切片，檸檬酸鉛醋酸鈾雙染色，電鏡下觀察線粒體形態、結構。

1.3.2體視學分析[4,5]：選擇有超微結構改變的卵巢上皮細胞拍照后，采用體視學網格測試系統，以點計數法測量并計算線粒體體密度(Vvm，%)、線粒體外膜表面積密度(Sv,μm-1)、線粒體面數密度(Nm，μm-1)。Vvm= ∑Pmi/∑Ppi；Sv= 4/Z·∑Nmi/∑Ppi；Nm=∑Nmi/a∑Ppi。

1.4occludin和ZO-1免疫組化染色

1.4.1操作方法：采用免疫組化MaxVision快捷法進行occludin/ZO-1檢測。操作步驟：常規固定、包埋卵巢組織樣本，脫蠟、梯度酒精脫水。將脫蠟水化后組織切片置入已沸騰的緩沖液內加熱至工作溫度(105℃)和工作壓力(90kPa)，噴汽2 min后沖淋冷卻以修復組織抗原。3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶，PBS沖洗3 min ×3次，甩去血清。用PBS(pH 7.4)沖洗3 min ×3次，加50 μl一抗(1∶100稀釋);4℃冰箱孵育過夜；除去PBS液，加50 μl酶標抗鼠/兔聚合物(二抗)，室溫孵育15 min。PBS沖洗，除去PBS液，加50μl新鮮配制的DAB溶液后鏡下觀察。自來水沖洗、蘇木素復染，0.1% HCl分化；自來水沖洗返藍。經梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。以PBS 代替一抗作為陰性對照。

1.4.2結果判定：所有石蠟切片由病理科醫師獨立評判后綜合評定。occludin 和ZO-1陽性物為細胞漿中有棕黃色細顆粒物，計算陽性單位(PU)：

公式中Gα為待測結構α的平均灰度，GA為含有α的A區域的平均灰度，Gmax為檢測儀器的最大灰度，AAα為α相在A區域中的面積密度。

在相同電壓及相同亮度條件下，用20倍物鏡攝取各組上述切片圖像傳送至計算機顯示屏，采用Nikon-MiVnt顯微圖像分析系統進行免疫組化圖像定量分析，occludin/ZO-1陽性表達的相對強弱用平均灰度值(即積分光密度值，IOD)表示。

1.5統計學處理

2結果

2.1各組線粒體超微結構和體視學變化

2.1.1超微結構： 電鏡觀察，對照組線粒體及內質網無異常(圖1A)。SC組線粒體腫脹、體積明顯增大、緊擠于細胞內，呈典型巨線粒體，脊斷裂明顯(圖1B)。MC組線粒體改變以增生為主，體積較小、數量增多(圖1C)。

2.1.2體視學變化：三組Nm、Vvm 、Sv差異均具有統計學意義(P<0.05)。MC組線粒體Nm、Vvm和Sv較對照組明顯降低(P<0.05，P<0.01)，SC組線粒體Nm、Vvm和Sv較MC組明顯升高P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1　各組線粒體Nm、Vvm及Sv比較

注：與對照組比較，1)P<0.05,2)P<0.01；與MC組比較，3)P<0.05,4)P<0.01

2.2各組occludin/ZO-1蛋白表達的PU和IOD

對照組卵巢上皮細胞occludin/ZO-1呈陽性表達，胞漿內有較多棕黃色顆粒物(圖2A、圖2D)。SC組呈弱表達，癌細胞胞漿內僅見少量棕黃色顆粒物(圖2B和圖2E)，MC組呈強陽性表達，胞漿內棕黃色顆粒物明顯。定量分析表明MC組occludin/ZO-1 PU明顯高于對照組(P<0.05)，IOD明顯低于對照組(P<0.05)；SC組occludin/ZO-1 PU較MC組明顯降低(P<0.01)，IOD較MC組明顯升高(P<0.01)。見圖 2、表2。

表2　各組卵巢上皮細胞occludin/ZO-1蛋白表達PU及IOD的比較

注：與對照組比較，1)P<0.05；與MC組比較，2)P<0.01

[本文圖1、圖2見封3]

3討論

本研究發現，SC組細胞呈巨型線粒體改變及脊斷裂，與國外學者關于細胞脹亡(oncosis)的觀點相吻合[6]。細胞脹亡作為一種有別于凋亡的細胞死亡方式，在多種疾病的發生發展過程中起重要作用[7]。業已證明，細胞壞死時胞膜的不可逆代謝、功能和結構損傷和完整性消失，造成膜通透性嚴重缺陷及膜上離子泵功能衰竭引起的細胞水腫及線粒體腫脹，可能是導致SC細胞線粒體Nm、Vvm及Sv明顯增加的原因所在[8]；本文SC患者不僅表現為上述體視學參數的顯著增加(高于對照組和MC組)，且伴有明顯脊斷裂，提示線粒體腫脹與嵴破壞可能是卵巢癌后期改變的標志。MC細胞線粒體由于體積較小，因而Nm、Vvm和Sv較對照組降低，其數量較多可能與MC患者機體代謝增強，組織耗氧增加有關[4]。

資料顯示，TJ的occludin與相鄰細胞通過外環以拉鏈形式相互結合而產生細胞旁封閉作用，N端對TJ裝配和屏障功能保持起重要作用，C端則與ZO-1直接相連，共同調節TJ的結構變化[9]，不僅是TJ的關鍵組成部分，還控制與上皮瘤形成相關的表型變化[10]；ZO-1既是TJ的裝配平臺，也是occludin與細胞內骨架連接及信號轉導的重要結構[9,10]。有研究將致癌基因Raf-1 轉染至Pa-4細胞，導致了TJ功能完全喪失，并引起細胞生長及調控異常以及occludin表達下調和ZO-1分布模式改變[10]。當細胞癌變時，TJ異常可導致細胞極性改變，使細胞之間發生黏附、增殖與分化[11]。本研究中，TJ蛋白occludin和ZO-1在MC組表達增強(高于對照組)，而在SC組表達明顯降低，可能反映SC細胞極性破壞，膜通透性增強，也因此提示TJ蛋白可能作為調節因子而抑制腫瘤生長，如Poff 等[12]發現，轉染occludin基因進入腫瘤細胞,可影響腫瘤細胞表型,尤其是增加轉染腫瘤細胞對凋亡因素的敏感性；抑制occludin也可能作用于TJ，直接或間接參與調節細胞增殖、分化,接收和傳授PKC和Rho蛋白質等分子信號,共同抑制腫瘤細胞生長。

綜上，SC和MC線粒體超微結構與體視學分析結果存在差異，TJ蛋白的occludin/ZO-1表達也各不相同，初步認為巨線粒體改變的SC細胞TJ表達下調，而線粒體數量增多的MC細胞TJ表達較強，提示SC與MC兩種不同類型卵巢癌的病理改變可能與不同的信號轉導途徑有關，但其臨床生物學意義尚需進一步探索。

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譚樹芬(1973-)，女，基諾族，學士，副教授，主要從事婦科腫瘤學研究

參考文獻

1Wang L, Jin XS, Lin DJ, et al. Clinicopathologic significance of claudin-6,occludin, and matrix metalloproteinases 2 expression in ovarian carcinoma[J]. Diagn Pathol, 2013, 8(1):190-198.

2祝英杰,阮友琴,趙艷艷，等. 血清VEGF-C和CA125聯合檢測對卵巢癌淋巴結轉移的預測價值[J]. 腫瘤防治研究,2013,40(3):278-281.

3Zhu Y,Brnnstrom M, Janson PO,et al. Differences in expression patterns of tight junction proteins,clandin-1,3,4,and 5,in human ovarian surface epithelium as compared to epithelia in inclusion cysts and epithelial ovarian tumoars[J].Int J Cancer, 2006,118(8) :1884-1981.

4譚樹芬，盧玉波，楊宏英.卵巢癌VEGF表達及癌細胞線粒體超微結構的改變[J]. 微循環學雜志，2009,19(1):17-19.

5Mumcuoglu EU, Hassanpour R, Perkins G, et al.Computerized detection and segmentation of mitochondria on electron microscope images[J]. J Microscopy, 2012,246(3):248-265.

6Sun L,Zhao Y,Yuan H,et al.Solamargine, a steroidal alkaloid glycoside, induces oncosis in human K562 leukemia and squamous cell carcinoma KB cells[J]. Cancer Chemotherap Pharmacol , 2011, 67(4) : 810-821.

7Azrak S, Ayyasamy V, Zirpoli G, et al.CAG repeat variants in the POLG1 gene encoding mtDNA polymerase-Gamma and risk of breast cancer in African-American women[J]. PLoS ONE,2011,7(1): e29548.

8Chen L, Liu T, Tran A, et al.OPA1 Mutation and late-onset cardiomyopathy:mitochondrial dysfunction and mtDNA instability[J].J Am Heart Assoc,2012,1(4):e003012.

9Hein S，Amon E，Kostin S，et al. Progression from compensated hypertrophy to failure in the pressure overloaded human heart：structural deterioration and compensatory mechanisms[J]．Circulation，2003，107(7)：984-991.

10Li D，Mrsny RJ.Oncogenic raf-1 disrupts epithelial tight junctions via downregulation of occludin[J]. J Cell Biol, 2000,148(4):791-800.

11Shang XY, Lin XJ, Manorek G,et al.Claudin-3 and claudin-4 regulate sensitivity to cisplatin by controlling expression of the copper and cisplatin influx transporter CTR1[J]. Mol Pharmacol,2013,83(1):85-94.

12Poff AM, Ari C, Seyfried TN, et al. The ketogenic diet and hyperbaric oxygen therapy prolong survival in mice with systemic metastatic cancer[J]. PLoS ONE, 2013，8(6): e65522.

Different of Mitochondrial Construction and Expression Abnormity of Tight Junction Protein in the Serous and Mucinous Ovarian Cystadenocarcinoma

TAN Shu-fen ,YANG Hong-ying, ZHANG Shao, ZHU Yin-jie

Department of Obstetrics and Gynecology,The 3rd Affiliated Hospital, Kunming Medical University,Kunming 650018, China

【Abstract】Objective: To investigate the mechanisms and the abnormal differences of mitochondrial construction and the tight junction (TJ) protein occludin/ZO-1 expression in serous ovarian cystadenocarcinoma (SC) and mucinous ovarian cystadenocarcinoma (MC).Method: 30 patients with ovarian cystadenocarcinoma in 15 cases for SC group (SC group), 15 cases of MC (MC), an alternate 3 cases of myoma of uterus controls (control group). The mitochondrial ultrastructure were observed by electron microscope.The number density of mitochondria (Nm), volume density (Vvm) and the outer membrane surface density (Sv) were detected by the stereology analytical method. The ovarian epithelial cell protein positive unit(PU)of occludin/ZO-1 and its power degree (expressed in integral density, IOD) of each group were detected by immunohistochemical method.Results: Under electron microscopy, there were no abnormal mitochondria and endoplasmic reticulum in the control group.Mitochondria of MC group was small in size, quantity was more,the mitochondria Nm, Vvm and Sv significantly lower than the control group (P< 0.05);SC group, mitochondrial volume, spinal fracture significantly, mitochondria Nm, Vvm and Sv MC group significantly increased (P<0.01).Immunohistochemical analysis showed that positive rate of occludin and ZO-1 in MC group was obviously higher than that of control group(24.23±4.74PU Vs 21.07±5.51PU，37.07±3.58PU Vs 20.46 ±4.89PU，P<0.05)，IOD significantly lower than the control group (72.39±9.86 Vs 92.38±7.17，73.51±6.86 Vs 80.34±7.04，P<0.05).Occludin and ZO - 1 in SC group were significantly lower than the control group(11.50±4.15PU Vs 21.07±5.51PU，16.24±3.61PU Vs 20.46 ±4.89PU，P<0.05),IOD was significantly higher than the control group(101.38±6.16 Vs 92.38±7.1，92.78±3.07 Vs 80.34±7.04，P<0.01).Conclusion: The mitochondria stereology characteristics of patients with SC and MC are obviously different,may be related to express abnormalities of occludin/ZO-1 with TJ proteins.

【Key words】Serous ovarian cystadenocarcinoma；Mucinous ovarian cystadenocarcinoma; Mitochondria ultrastructure;Stereology; Tight junctionprotein

作者簡介：本文第一

[中圖分類號]R730.231

[文獻標識碼]A

[文章編號]1005-1740(2016)01-0010-04

*[基金項目]云南省教育廳科研基金(2010Y184)

[作者單位]昆明醫科大學第三附屬醫院婦瘤科，昆明 650018

本文2015-10-12收到，2016-01-06修回