三價(jià)鐵對燈盞花素與溶菌酶相互作用的影響

鄭茂東，顏娟，王愛萍，趙秀花，張鶴鳴

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北張家口 075000)

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三價(jià)鐵對燈盞花素與溶菌酶相互作用的影響

鄭茂東，顏娟，王愛萍，趙秀花，張鶴鳴

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北張家口 075000)

摘要：目的探討三價(jià)鐵(Fe3+)在模擬人體正常生理環(huán)境下對溶菌酶與燈盞花素相互作用的影響。方法運(yùn)用同步熒光光譜法觀察有無Fe3+參與時燈盞花素與溶菌酶的相互作用。結(jié)果有、無Fe3+存在，燈盞花素與溶菌酶均可形成基態(tài)復(fù)合物從而猝滅溶菌酶的內(nèi)源性熒光，猝滅原因均為靜態(tài)猝滅。有、無Fe3+存在，熱力學(xué)溫度為308 K時燈盞花素與溶菌酶的結(jié)合常數(shù)分別為1.15×106、1.08×106L/mol，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為0.993、1.19。在Fe3+存在時，燈盞花素與溶菌酶作用力由疏水作用改變?yōu)榉兜氯A力和氫鍵，結(jié)合位點(diǎn)靠近色氨酸，并使色氨酸的疏水性增強(qiáng)。結(jié)論Fe3+不改變燈盞花素與溶菌酶的猝滅作用機(jī)制，但使得兩者結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和作用力類型發(fā)生改變。

關(guān)鍵詞：Fe3+；燈盞花素；溶菌酶；熒光光譜法；同步熒光法

溶菌酶是小分子堿性蛋白，普遍存在生物機(jī)體內(nèi)，能與大量外源性和內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合。研究溶菌酶有利于從微觀水平上探討藥物在生物體內(nèi)的藥理作用、代謝轉(zhuǎn)化過程和不良反應(yīng)，為臨床合理用藥提供參考[1~4]。燈盞花素是從中藥燈盞花中提取的黃酮類成分，其主要有效成分為燈盞乙素，是一種黃酮苷類化合物，具有擴(kuò)張腦血管、增加腦血流量等作用[5]。鐵在生命體系中是常見的微量金屬元素，其參與的生物過程包括NDA合成、呼吸作用、能量轉(zhuǎn)換、氧的運(yùn)輸?shù)取?014年6月～2015年1月，我們觀察人體內(nèi)微量金屬元素鐵(Fe3+)對燈盞花素與溶菌酶作用的影響，進(jìn)而了解燈盞花素在人體內(nèi)的吸收、分布、代謝以及其藥理作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1儀器和試劑 熒光分光光度計(jì)(美國 Varian 公司，附帶Peltier 電子恒溫裝置)；電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；可調(diào)節(jié)加樣器(芬蘭 Biohit 公司)；pHS-3C 型精密 pH 計(jì)(上海雷磁儀器廠)；溶菌酶(美國sigma 公司，用緩沖溶液配制濃度為1.06×10-4mol/L)；燈盞花素(昆明龍津藥業(yè)股份有限公司，批號：20140512-1，用緩沖溶液配制濃度為1.10×10-4mol/L)；Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液(濃度為0.02 mol/L，pH 7.40，內(nèi)含0.15 mol/L的NaCl)；FeCl3為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

2結(jié)果

2.1燈盞花素、燈盞花素-Fe3+與溶菌酶相互作用隨著燈盞花素濃度的增加，溶菌酶的熒光強(qiáng)度逐漸降低，同時最大發(fā)射波長藍(lán)移3~5 nm。加入Fe3+前后溶菌酶的峰形和峰位沒有發(fā)生明顯變化，但是猝滅程度明顯增大。見圖1。表明燈盞花素與溶菌酶發(fā)生結(jié)合作用，F(xiàn)e3+對其相互作用有一定影響。

注：A 燈盞花素與溶菌酶相互作用　　B燈盞花素-Fe3+與溶菌酶相互作用

2.2燈盞花素、燈盞花素-Fe3+與溶菌酶作用相關(guān)參數(shù)變化KSV隨著溫度的升高而減小，KLB隨著溫度的升高而增大，說明燈盞花素對溶菌酶的猝滅過程是由于兩者形成不發(fā)光的復(fù)合物而引起的靜態(tài)猝滅。Fe3+存在時，燈盞花素對溶菌酶的猝滅程度有所增加，但猝滅類型未發(fā)生改變，仍為靜態(tài)猝滅。Fe3+存在時，燈盞花素與溶菌酶的結(jié)合常數(shù)K增大，表明Fe3+參與加強(qiáng)了燈盞花素與溶菌酶的作用，但是結(jié)合位點(diǎn)數(shù)近似等于1。熱力學(xué)參數(shù)△rHm>0，△rSm>0，可判定燈盞花素與溶菌酶作用力為典型的疏水作用。Fe3+存在下，△rHm<0，△rSm<0，推測燈盞花素與溶菌酶的作用力類型改變以氫鍵和范德華力為主。見表1。

2.3燈盞花素、燈盞花素-Fe3+對溶菌酶構(gòu)象的影響溶菌酶中色氨酸和酪氨酸殘基的熒光強(qiáng)度均有規(guī)律減弱，色氨酸殘基的熒光強(qiáng)度降低更加明顯，說明溶菌酶的熒光主要是色氨酸殘基，推測燈盞花素與溶菌酶的結(jié)合位點(diǎn)更接近于色氨酸殘基。色氨酸的最大發(fā)射波長發(fā)生藍(lán)移，表明燈盞花素的加入使色氨酸殘基附近的極性減弱，疏水環(huán)境增強(qiáng)，肽鏈的伸展程度減小[12]。Fe3+存在下，酪氨酸和色氨酸殘基的熒光猝滅程度增加，峰形和峰位發(fā)生改變，說明Fe3+參與了燈盞花素與溶菌酶的作用過程，但未改變色氨酸殘基附近的環(huán)境。

表1　燈盞花素、燈盞花素-Fe3+與溶菌酶作用的相關(guān)參數(shù)

3討論

溶菌酶又稱為N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶或胞壁質(zhì)酶，研究蛋白的空間構(gòu)象、酶動力學(xué)、分子進(jìn)化與分子免疫間的關(guān)系時，溶菌酶作為模型體系可提供載體。另外，溶菌酶也是血漿中重要選擇性載體蛋白，能夠與許多內(nèi)、外源性物質(zhì)結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮其生物功能。同時，溶菌酶是臨床應(yīng)用的有效抗菌消炎劑，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等致病菌有抑殺作用，具有抗病毒作用，參與機(jī)體多種免疫反應(yīng)。人體溶菌酶的濃度可用于診斷多種疾病，如再生障礙性貧血和急性白血癥的診斷指標(biāo)之一是血清溶菌酶的水平低于正常值。通過測定尿液和體內(nèi)的溶菌酶水平，可以判斷腎小管功能障礙性疾病和燒傷患者的病情嚴(yán)重程度。溶菌酶作為一種天然蛋白質(zhì)，在醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用前景廣闊[1~4]。

大量研究顯示，燈盞花素具有擴(kuò)張腦血管、增加腦血流量等作用，深入研究燈盞花素在體內(nèi)的藥效、不良反應(yīng)及作用機(jī)制有重要的臨床意義。探討燈盞花素與溶菌酶的相互作用，有利于從分子水平上闡明燈盞花素在體內(nèi)的作用機(jī)制，了解燈盞花素發(fā)揮藥效的作用機(jī)理，也是當(dāng)前生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。另外，人體是一個復(fù)雜的體系，人體內(nèi)存在多種金屬離子，能與藥物或酶蛋白結(jié)合發(fā)揮獨(dú)特作用。本文利用同步熒光光譜法模擬正常人體生理環(huán)境下Fe3+對溶菌酶、燈盞花素的相互作用及影響，將燈盞花素-溶菌酶二元體系拓展至燈盞花素-金屬離子-溶菌酶三元體系加以研究，得到更加豐富的理論數(shù)據(jù)。表明Fe3+雖然不改變燈盞花素與溶菌酶的猝滅作用機(jī)制，但使得兩者結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和作用力類型發(fā)生改變。Fe3+存在時，燈盞花素與溶菌酶的結(jié)合常數(shù)增大，表明Fe3+參與并加強(qiáng)了燈盞花素與溶菌酶的作用。從藥學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)兩個角度考慮，由于Fe3+的存在，燈盞花素在血漿中釋放更緩慢，貯留時間延長，有利于延長燈盞花素在體內(nèi)的作用時間，使其藥效更持久。說明復(fù)雜的生命體系中金屬離子對物質(zhì)的代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)有獨(dú)特作用。

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(收稿日期：2015-10-09)

中圖分類號：R969

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號：1002-266X(2016)05-0079-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.05.033

基金項(xiàng)目：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃項(xiàng)目(ZD20140167)；張家口市科技局科技計(jì)劃項(xiàng)目(1421132D)。