替莫唑胺耐藥細胞系SHG-44/TR生物學特征及其耐藥機制

丁鳳霞，朱仲玲，閻昭

(天津醫科大學腫瘤醫院·國家腫瘤臨床醫學研究中心·天津市腫瘤防治重點實驗室，天津 300060)

?

替莫唑胺耐藥細胞系SHG-44/TR生物學特征及其耐藥機制

丁鳳霞，朱仲玲，閻昭

(天津醫科大學腫瘤醫院·國家腫瘤臨床醫學研究中心·天津市腫瘤防治重點實驗室，天津 300060)

摘要：目的探討對替莫唑胺耐藥的人膠質瘤細胞系SHG-44/TR的生物學特征及耐藥機制。方法通過體外分階段劑量遞增誘導法使人腦膠質瘤細胞系SHG-44對替莫唑胺產生耐藥性，建立耐藥細胞系SHG-44/TR。采用細胞集落形成試驗和噻唑藍比色法檢測SHG-44/TR增殖情況、耐藥性及耐藥指數；采用 Western -blotting法檢測耐藥蛋白O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(MGMT)及人類錯配修復蛋白2(hMSH2)表達變化；流式細胞儀檢測SHG-44/TR細胞周期變化。結果歷時8個月成功建立了對替莫唑胺耐藥的人膠質瘤細胞 SHG-44 /TR。與SHG-44比較，SHG-44/TR對替莫唑胺的耐受程度差異有統計學意義(P<0.05)；SHG-44/TR沒有細胞周期阻滯現象；SHG-44/TR較親本細胞MGMT蛋白表達無變化，hMSH2表達差異有統計學意義(P<0.05)。結論耐替莫唑胺膠質瘤細胞系SHG-44/TR hMSH2表達降低,其耐藥機制可能為DNA錯配修復缺失。

關鍵詞：替莫唑胺；耐藥機制；腦膠質瘤；錯配修復；O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶

多形性膠質母細胞瘤是惡性程度較高且最為常見的腦腫瘤[1]。臨床上以手術治療為主、替莫唑胺化療聯合放療為輔的治療方案在延長膠質瘤患者生存期方面起了很大作用[2，3]。但是，膠質瘤患者預后仍然不理想，繼發性耐藥的出現是臨床替莫唑胺化療失敗的主要原因；耐藥機制包括O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶 ( MGMT)的過表達和DNA錯配修復(MMR)的缺失以及堿基切除修復等[4]。2014年4～12月，本文采用替莫唑胺為誘導劑，通過濃度梯度遞增誘導法建立對替莫唑胺耐藥的腦膠質瘤細胞系，并探討其在MMR方面的耐藥機制。

1材料與方法

1.1材料人惡性腦膠質瘤細胞株SHG-44、替莫唑胺由天津天士力有限公司提供；改良型培養基(DMEM)、胰蛋白酶、胎牛血清購自Gibico公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)、青霉素、鏈霉素均購自Sigma公司；兔抗人單克隆抗體MGMT、兔抗人單克隆抗體MSH2、鼠抗人單克隆抗體β-actin抗體均購自CST公司；抗體工作濃度均為1∶ 1 000；SDS裂解液購自碧云天生物技術公司。另有CO2培養箱、流式細胞儀、酶標儀、熒光倒置顯微鏡等。

1.2細胞培養及耐藥細胞系SHG-44/TR的建立SHG-44細胞置于體積分數為10% 胎牛血清、青霉素100 IU/mL和鏈霉素100 μg/mL的DMEM培養液中，在37 ℃、體積分數為5% CO2和一定濕度的條件下孵育培養，每2 d更換培養液1次，當細胞增殖至80%時用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。將處于對數生長區的SHG-44細胞制成1×105/mL細胞懸液，培養24 h后加入初始誘導濃度的替莫唑胺(1 μmol/L)[5]，繼續培養15 d，然后將藥物濃度倍增。當替莫唑胺倍增至16 μmol/L時，每次將濃度提高16 μmol/L至終濃度200 μmol/L，每個濃度都穩定培養15 d，歷時8個月建成SHG-44耐藥細胞系，命名為SHG-44/TR。

1.3細胞形態觀察及MTT法繪制生長曲線將SHG-44和SHG-44/TR分別傳代，穩定培養2 d，顯微鏡下觀察細胞形態并用熒光倒置顯微鏡拍照。取對數生長期的SHG-44和SHG-44/TR細胞消化計數，制成1×104/mL細胞懸液以每孔100 μL鋪于96孔板中，每種細胞每個時間段設3個復孔，每24 h在酶標儀490 nm處檢測OD值，連續檢測7 d。以OD值為縱坐標，時間為橫坐標繪制細胞生長曲線。

1.4SHG-44/TR耐藥指數檢測將處于對數生長期的SHG-44/TR和SHG-44以2×104/mL分別鋪于96孔板中，每孔100 μL，每個濃度設5個復孔，過夜培養后加入含替莫唑胺藥物培養基100 μL，使終濃度分別為62.5、125、250、500、1 000 μmol/L，并設空白對照組和調零孔。37 ℃ CO2培養箱內繼續培養96 h后，每孔加入20 μL 濃度為5 mg/mL的MTT，置于CO2培養箱內，4 h后小心吸出孔內液體，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min，使藍紫色甲瓚結晶溶解，酶標儀檢測490 nm處的各孔光吸收值(OD值)。計算SHG-44和SHG-44/TR的半數抑制率(IC50)和耐藥指數。

1.5替莫唑胺對SHG-44和SHG-44/TR的抑制情況檢測取對數生長期SHG-44、SHG-44/TR細胞，調整細胞密度為4×102/mL，以每孔1 mL接種于12孔板中，貼壁后，各實驗組加入含藥培養液1 mL(濃度分別為0、25、50、100、200、300、400、500 μmol/L)，每組設2個復孔。每隔3 d換1次液，2周后取出培養板，甲醇固定10 min，加入結晶紫染色液染色30 min。顯微鏡下觀察克隆大小及數量。

1.6細胞周期檢測消化收集SHG-44、SHG-44/TR以及加替莫唑胺處理的細胞，室溫下1 000 r/min離心5min，預冷PBS重懸細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入2 mL 75%預冷冰乙醇，-20 ℃冰箱內固定過夜。第2天將固定好的細胞取出1 000 r/min離心5 min，棄冰乙醇，預冷PBS重懸清洗細胞再1 000 r/min離心5 min。每管加入RnaseA、Triton-X和PI混合液100 μL，室溫避光孵育20 min，流式細胞儀檢測細胞周期，使用Cellquest軟件采集樣本，用WinMDI2.9軟件行細胞周期分析。

1.7耐藥相關蛋白表達情況檢測SDS裂解液裂解SHG-44、SHG-44/TR，提取細胞內總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，上樣40 μg，15%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉移至PVDF膜封閉1 h，4 ℃孵育MGMT。加入人類錯配修復蛋白2(hMSH2)單克隆抗體(一抗)過夜，熒光二抗室溫孵育1 h，熒光掃描儀掃描。

2 結果

2.1SHG-44與SHG-44/TR形態學變化SHG-44腦膠質瘤細胞系為成纖維狀細胞，梭形并呈現多觸角，排列緊密，大小均勻，邊界清晰；而替莫唑胺誘導的耐藥細胞系SHG-44/TR則形態不規則，觸角減少，偶有細胞形態變圓，形態變大，排列松散，大小不均勻。

2.2SHG-44與SHG-44/TR細胞系倍增時間比較耐藥細胞系SHG-44/TR比SHG-44生長速度明顯減慢。見圖1。

圖1　SHG-44和SHG-44/TR細胞生長曲線

2.3SHG-44/TR細胞株耐藥指數SHG-44細胞系IC50值為(264±23.99)μmol/L， SHG-44/TR細胞IC50值為(1 684±32.17)μmol/L，SHG-44/TR對SHG-44膠質瘤細胞耐藥指數[IC50(SHG-44/TR)/IC50(SHG-44) ]約為6，二者對替莫唑胺的耐受程度差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4替莫唑胺對SHG-44、SHG-44/TR細胞克隆形成的抑制作用替莫唑胺對SHG-44/TR細胞克隆形成抑制作用明顯低于SHG-44細胞。在替莫唑胺濃度200 μmol/L以上時，SHG-44沒有克隆形成，而SHG-44/TR細胞存活率在70%以上，兩者比較差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

圖2　不同替莫唑胺濃度對SHG-44和

2.5SHG-44/TR相對SHG-44細胞周期的變化SHG-44細胞對照組和SHG-44加入100 μmol/L 替莫唑胺組G1期細胞分別為 (50.73±5.74)%和(38.11±4.28)%，G2期細胞分別為(8.28±1.26)%和(20.2±2.11)%，S期細胞分別為(40.99±3.21)%和(41.74±2.79)%；SHG-44細胞加藥組相對對照組細胞周期停滯在G2期，且G1期減少，S期基本不變。SHG-44/TR細胞對照組和SHG-44/TR加入100 μmol/L 替莫唑胺組G1期細胞分別為(49.97±5.23)%和(43.73±3.89)%，G2期細胞分別為(14.76±1.54)%和(16.11±1.22)%，S期細胞分別為(35.12±2.98)%和(40.17±3.12)%；兩組細胞各個周期變化均不大，細胞周期沒有停滯現象出現。

2.6SHG-44/TR耐藥相關蛋白表達水平變化SHG-44、SHG-44/TR膠質瘤細胞均不表達MGMT；SHG-44高表達hMSH2，SHG-44/TR細胞內hMSH2表達量較SHG-44明顯降低(P<0.05)。

3討論

作為第二代烷化劑替莫唑胺是治療膠質瘤的首選藥，然而膠質瘤對其耐藥卻經常發生。本文采用替莫唑胺濃度從低到高的方法經8個月成功誘導成SHG-44耐藥膠質瘤細胞系SHG-44/TR。MTT法檢測發現SHG-44/TR相對親本細胞系生長速度明顯減慢，耐藥指數為6；而且SHG-44/TR細胞形態發生改變，細胞變大，消耗能量增加，增殖能力變慢。對于MGMT高表達的細胞系，降低MGMT表達是克服耐藥的主要方法[6]。本文MGMT在SHG-44和SHG-44/TR中都沒有表現出高表達[7]，因此SHG-44/TR所產生的耐藥性并非MGMT的高表達產生。MGMT低表達或不表達的耐藥細胞系中，MMR缺失將代替MGMT高表達產生耐藥，于是本研究檢測了MMR相關蛋白hMSH2。結果顯示，耐藥細胞系較親本細胞hMSH2蛋白明顯降低。盡管沒有觀察MGMT表達變化，但是hMSH2蛋白表達下調使膠質瘤細胞SHG-44產生了耐藥性。

MMR是一個修復DNA合成過程中產生的核苷酸堿基錯配的系統[8]。當MGMT不存在時，O6-MG可以與胸腺嘧啶配對；在MMR高表達的細胞中O6-MEG-T錯配由一個mutS所識別后，新合成鏈即被切除[9]，其中mutS是一個包含MMR蛋白hMSH2和hMSH6的異二聚體復合物。當另一條鏈合成時，修復循環再次發生，這些無效插入切除胸腺嘧啶的過程導致細胞周期阻滯和凋亡[10]。因此，敏感細胞系SHG-44加入替莫唑胺 24 h后，細胞周期阻滯在G2期，此時激活DNA修復功能，人類細胞中hMSH2和hMSH6組成的異源二聚體mutS主要識別堿基錯誤配對和單個無配對甲基環，hMSH2和hMSH3組成的異源二聚體mutS主要識別多個堿基插入或缺失產生的無配對堿基環[11]。mutS蛋白與錯配堿基結合，并有MutH和MutL蛋白被募集到附近形成復合物，其中MutH結合在半甲基化GATC序列上，在甲基化堿基的對側鏈切割DNA，啟動修補合成[12]。如果DNA損傷不能被修復，細胞周期檢測點就會啟動細胞周期永久停滯機制或者凋亡機制[13]。而如果MMR受損或者缺失將導致MMR無法識別替莫唑胺造成的G-A或者A-C錯配，在DNA損傷情況下細胞存活。這將導致DNA復制，并允許細胞周期繼續，由此使得細胞對替莫唑胺耐藥[14]。因此，SHG-44/TR加入替莫唑胺 24 h后，細胞周期變化較小，沒有周期阻滯現象。此外，耐藥細胞SHG-44/TR增殖減慢，消耗能量增加，導致了微環境的弱酸性。而膠質瘤細胞微環境的酸化也是引起耐藥的一個重要原因，這些酸性物質能被各種離子泵轉運到細胞外, 使腫瘤細胞外環境呈酸性, 從而抑制了弱堿性抗腫瘤藥物替莫唑胺在腫瘤細胞中的聚集而產生一定的耐藥性[15]。

參考文獻：

[1] Johannessen TC , Bjerkvig R. Molecular mechanisms of temozolomide resistance in glioblastoma multiforme[J]. Expert Rev Anticancer Ther, 2012,12(5):635-642.

[2] Wakabayashi T. Clinical trial updates for malignant brain tμmol/Lors[J]. Current Molecular Pharmacology, 2011,51(11):853-856.

[3] Shen WJ, Hu JA, Zheng JS. Mechanism of temozolomide-induced antitμmol/Lour effects on glioma cells[J]. Int Med Res, 2014,42(1):164-172.

[4] Johannessen TC, Bjerkvig R,Tysnes BB. DNA repair and cancer stem-like cells--potential partners in glioma drug resistance[J]. Cancer Treat Rev, 2008,34(6):558-567.

[5] Zhang J, Laughtona JZ, Bradshawa S, et al.Acquired resistance to temozolomide in glioma cell lines molecular mechanisms and potential translational applications[J]. Clin Transl Res, 2010,72(2):102-114

[6] Jiang G, Wei ZP, Zheng J, et al. A novel approach to overcome temozolomide resistance in glioma and melanoma: Inactivation of MGMT by gene therapy[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011,406(3):311-314.

[7] Smalley S, Chalmers AJ, Morley SJ. mTOR inhibition and levels of the DNA repair protein MGMT in T98G glioblastoma cells[J]. Mol Cancer, 2014, 13(4):144-153.

[8] Zhang J, Stevens MF, Bradshaw TD. Temozolomide: mechanisms of action, repair and resistance[J]. Curr Mol Pharmacol, 2012, 5(1): 102-114.

[9] Grassi T, Calcagno A, Marzinotto S, et al. Mismatch repair system in endometriotic tissue and eutopic endometriμmol/L of unaffected women[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015,8(2):1867-1877.

[10] Park CK, Kim JE, Kim JY, et al. The changes in MGMT promoter methylation status in initial and recurrent glioblastomas[J]. Transl Oncol, 2012,5(5):393-409.

[11] Castro GN, Zoppino FC,Fanelli MA,et al. Effects of temozolomide (TMZ) on the expression and interaction of heat shock proteins (HSPs) and DNA repair proteins in hμmol/Lan malignant glioma cells[J]. Cell Stress Chaperones, 2015,20(2):253-265.

[12] Felsberg J, Thon N,Eigenbrod S,et al. Promoter methylation and expression of MGMT and the DNA mismatch repair genes MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2 in paired primary and recurrent glioblastomas[J]. Int J Cancer, 2011,129(3):659-670.

[13] Fu D, Calvo JA, Samson LD. Balancing repair and tolerance of DNA damage caused by alkylating agents[J]. Nat Rev Cancer, 2012,12(2):104-120.

[14] Messaoudi K, Clavreul A, Lagarce F. Toward an effective strategy in glioblastoma treatment. Part I: resistance mechanisms and strategies to overcome resistance of glioblastoma to temozolomide[J]. Drug Discov Today, 2015,17(4):568-581.

[15] Dean M. ABC transporters, drug resistance, and cancer stem cells[J]. J Mammary Gland Biol Neoplasia, 2009,14(1): 3-9.

Biological characteristics and resistance mechanism of temozolomide resistance cell line SHG-44/TR

DINGFengxia,ZHUZhongling,YANZhao

(TianjinMedicalUniversityCancerInstituteandHospital,Tianjin300060,China)

Abstract:Objective To investigate the biological characteristics and resistance mechanism of human glioma cell line SHG-44/TR which is resistant to temozolomide (TMZ). MethodsWe induced the human glioma SHG-44 to be resistant to TMZ by dose escalation in vitro, and then established the drug-resistant cell line SHG-44/TR. The colony formation assay and MTT colorimetric assay was used to measure the proliferation, resistance and resistance index of SHG-44/TR cells; Western blotting was used to detect the expression changes of resistance protein O6-methylguanine-DNA methyl transferase (MGMT) and human mismatch repair protein 2 (hMSH2); and flow cytometry was used to detect the SHG-44/TR cell cycle. ResultsAfter eight months, we successfully established TMZ-resistant glioma cells SHG-44/TR. Significant difference was found in the TMZ-resistance between SHG-44 and SHG-44/TR (P<0.05). SHG-44/TR had no cell cycle arrest phenomenon. The expression of MGMT protein did not change in SHG-44/TR cells as compared with that of parent cells, but the expression of hMSH2 was significantly decreased (P<0.05). ConclusionsThe hMSH2 expression of TMZ-resistant glioma cells SHG-44/TR is decreased, and the mechanism may be DNA mismatch repair missing.

Key words:temozolomide; drug-resistance mechanism; glioma; mismatch repair; O6-methylguanine-DNA methyltransferase

(收稿日期：2015-08-14)

中圖分類號：R739.41

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)05-0019-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.05.007

通信作者簡介：閻昭(1973-)，男，主任藥師，研究方向為腫瘤藥理學。參與或承擔國家 863 課題、“十二五”重大新藥創制重大專項子課題、“十一五”重大新藥創制重大專項子課題、天津市科技支撐計劃重點項目等多項課題研究。E-mail：yanzhaopaper@163.com

作者簡介：第一丁鳳霞(1990-)，女，在讀碩士，研究方向為腫瘤藥理學。E-mail：FengxDing@126.com

基金項目：“十二五”重大新藥創制科技重大專項課題(2013ZX09303001)；國家自然科學基金項目(81402481)；天津衛生局科技基金項目(2014KZ085)。