MMP-9、AECA、ANCA蛋白在川崎病外周血的表達及其與冠狀動脈損害的關系

王曉華，王倩，趙建美

(南通大學附屬醫院，江蘇南通226001)

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MMP-9、AECA、ANCA蛋白在川崎病外周血的表達及其與冠狀動脈損害的關系

王曉華，王倩，趙建美

(南通大學附屬醫院，江蘇南通226001)

摘要：目的探討基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、抗內皮細胞抗體(AECA)和抗中性粒細胞胞質抗體(ANCA)在川崎病(KD)冠狀動脈損害中的作用及臨床意義。方法選取KD患兒42例，分為冠脈損害(CAL)組16例，無冠脈損害(NCAL)組26例，以20例普通發熱患兒、15例擇期手術患兒作為對照組。ELISA檢測各組血清MMP-9、AECA和ANCA蛋白水平；熒光定量PCR、明膠酶譜法分別測定單個核細胞MMP-9 mRNA表達及血清MMP-9酶活性。結果KD急性期外周血MMP-9 mRNA表達、蛋白水平及酶活性均高于兩對照組(P均<0.01)，CAL組較NCAL組升高更顯著(P均<0.05)。KD緩解期MMP-9 mRNA表達、蛋白水平及酶活性較急性期降低(P均<0.01)。KD急性期AECA、ANCA蛋白水平均高于兩對照組(P均<0.01)。CAL組ANCA蛋白水平高于NCAL組(P<0.01)。KD急性期血清AECA水平與MMP-9呈正相關(r=0.77，P<0.01)。急性期CAL組MMP-9、ANCA與冠狀動脈內徑/主動脈瓣環內徑比值呈正相關關系(r=0.57，P<0.05；r=0.88，P<0.01)。結果MMP-9、AECA、ANCA蛋白參與KD血管炎及冠脈損害過程，檢測其血清水平對早期預測冠脈損害有一定價值。

關鍵詞：川崎病；基質金屬蛋白酶-9；抗內皮細胞抗體；抗中性粒細胞胞質抗體；冠狀動脈損害

川崎病(KD)是一種病因不明的全身中小血管炎性疾病，該病最嚴重的并發癥是冠狀動脈損害，約4%的患兒因冠狀動脈狹窄導致成人期缺血性心臟病。基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)是由內皮細胞、單核/巨噬細胞、中性粒細胞等合成分泌的具有降解細胞外基質作用的蛋白酶。抗內皮細胞抗體(AECA)和抗中性粒細胞胞質抗體(ANCA)是存在于循環中的自身抗體，被視為原發性小血管炎特異的血清標志[1,2]，與多種血管炎性免疫性疾病有關。本研究觀察KD患兒外周血MMP-9、ANCA、AECA水平變化，探討KD血管炎及冠狀動脈損害的病理機制，為預測KD冠脈損傷及預后判斷提供理論依據。

1資料與方法

1.1 臨床資料 2012年6月～2013年12月本院診斷明確KD患兒42例，男25例、女17例，年齡(24.2±21.2)月；均符合第七次世界小兒KD研討會修訂的診斷標準[3]。42例患兒中，冠脈損害16例(CAL組)、左冠狀動脈內徑(LCA)/主動脈瓣環內徑(AAO)比值為0.26±0.04，無冠脈損害26例、LCA/AAO比值為0.16±0.02。超聲心動圖冠脈損害判斷標準：①冠狀動脈內膜回聲增強；②LCA超過鄰近節段內徑的1.5倍；③LCA/AAO比值>0.2[4]。CAL組16例中，單純冠狀動脈內膜回聲增強2例，LCA/AAO比值>0.2者14例(其中3例伴管壁內膜回聲增強，1例同時有LCA超過鄰近節段內徑的1.5倍)。隨機選取年齡、性別相仿的同期住院發熱(體溫≥38.5 ℃，主要為下呼吸道感染)患兒20例和兒外科擇期手術患兒15例分別作為發熱對照組和正常對照組。各組年齡、性別差異均無統計學意義(P均>0.05)。

1.2血液樣品采集分別于KD急性期(治療前)及緩解期(治療7~10 d)各采集外周靜脈血5 mL，取3 mL全血立即注入肝素抗凝試管，采用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，細胞經計數后用于實時定量PCR檢測。另2 mL血離心后取血清，保存于-80 ℃冰箱待測。兩對照組患兒只采血1次，樣品處理方法同上。

1.3血清MMP-9、AECA、ANCA蛋白水平檢測人MMP-9、AECA、ANCA ELISA試劑盒均購自美國R&D公司，嚴格按照試劑盒說明書的步驟操作，根據試劑盒中的標準品進行定量檢測。

1.4單個核細胞MMP-9 mRNA表達檢測采用熒光定量PCR法。在分離的外周血單個核細胞中加1 mL TRIzol勻漿，依次經過氯仿、異丙醇等提取總RNA，逆轉錄反應體系10 μL。取1μL cDNA行PCR，反應體系20 μL：Fast SYBR Green Master Mix(Roche) 10 μL，上下游引物各1μL，ddH2O 7μL，反應條件：95 ℃預變性5 min, 共45個循環(95 ℃、20 s，63 ℃、20 s，72 ℃、40 s)。

1.5血清MMP-9酶活性測定采用明膠酶譜法。冷凍血清室溫解凍后，取20 μL與等體積上樣緩沖液混勻，于含1%明膠溶液的10%丙烯酰胺凝膠垂直電泳槽中電泳，電泳結束后凝膠用含Triton X-100的明膠洗脫液振蕩洗滌1 h以洗去SDS。37 ℃孵育24 h，0.1%考馬斯亮藍染液染色約30 min，A、B、C脫色液(由甲醇、乙酸、三蒸水配制)脫色1 h，直至藍色背景上出現白色條帶。用凝膠圖象處理系統分析結果，以白色條帶的凈光密度值為相對定量樣品中酶活性大小。

2結果

2.1各組血清MMP-9、AECA、ANCA蛋白及單個核細胞MMP-9 mRNA表達見表1。

表1　各組血清MMP-9、AECA、ANCA蛋白及單個核細胞MMP-9 mRNA表達比較

注：與正常對照組比較，*P<0.01；與發熱對照組比較，aP<0.01，bP<0.05；與KD組緩解期比較，#P<0.01。

2.2CAL組、NCAL組血清MMP-9、AECA、ANCA蛋白及單個核細胞MMP-9 mRNA表達見表2。

表2　CAL組、NCAL組血清MMP-9、AECA、ANCA蛋白及單個核細胞MMP-9 mRNA表達比較

注：與NCAL組同期比較，*P﹤0.05，**P﹤0.01。

2.3各組外周血清MMP-9酶活性血清MMP-9酶活性凈光密度值CAL組急性期、緩解期分別為13.19±4.07、4.80±2.01，NCAL組分別為9.61±3.01、4.68±1.99，發熱對照組為4.92±1.26，正常對照組為2.65±0.99。CAL組、NCAL組急性期與緩解期比較血清MMP-9酶活性有統計學差異(P均<0.01)；CAL組、NCAL組急性期與發熱對照組、正常對照組比較血清MMP-9酶活性有統計學差異(P均<0.01)。

2.4各檢查指標的相關性KD急性期血清AECA水平與MMP-9水平呈正相關關系(r=0.77，P<0.01)。CAL組急性期血清MMP-9、ANCA水平均與LCA/AAO比值呈正相關關系(r=0.57，P<0.05；r=0.88，P<0.01)。

3討論

在MMPs超家族中，MMP-9與KD血管病變關系最為緊密。MMP-9能夠降解膠原酶和彈性蛋白酶，破壞血管內膜的內皮下層，有利于中性粒細胞、單核/巨噬細胞等向血管壁深層浸潤，導致血管壁結構的破壞[5]。Sakata等[6]在死亡KD患兒的冠狀動脈標本中檢測到異常增高的MMP-9，且發現急性期血清MMP-9水平高于對照組。我們的研究顯示，KD急性期MMP-9 mRNA和蛋白表達都增高，CAL組增高更顯著。由于在機體內發揮降解細胞外基質作用的只有激活狀態的MMP-9，即MMP-9酶，血清MMP-9蛋白水平升高不代表MMP-9酶活性增強，因此我們又測定外周血清MMP-9酶活性。結果顯示，KD急性期MMP-9酶活性亦增強，在CAL組尤為明顯。相關分析提示血清MMP-9與LCA/AAO比值呈正相關，即與冠脈損害嚴重程度呈正相關。故監測外周血MMP-9蛋白水平可了解血管基底膜降解情況，有助于早期預測冠狀動脈損害。

內皮細胞功能異常是導致KD血管炎及并發冠狀動脈損害的重要環節。AECA是B淋巴細胞產生的非特異性的自身抗體，與內皮細胞結合后可以通過以下途徑介導血管內皮損傷和功能障礙：①上調內皮細胞表面黏附分子的表達，吸引單核細胞、中性粒細胞的遷移和聚集；②增加炎性細胞因子、趨化因子的合成，活化內皮細胞；③通過補體或抗體的細胞毒作用引起內皮細胞的損傷和溶解；④與磷脂或者熱休克蛋白60結合誘導內皮細胞凋亡；⑤刺激內皮細胞產生血管性假血友病因子、組織因子，促進血栓形成[1,7,8]。早期研究顯示，AECA水平與KD患兒疾病的活動性相關，治療后AECA水平下降[9]。本研究顯示，KD組血清AECA水平高于兩對照組，但CAL組與NCAL組無差異，CAL組血清AECA與LCA/AAO比值也無相關性。由此可見，雖然AECA介導內皮損傷及功能障礙是引起KD血管炎及冠脈損害的因素之一，但急性期血清AECA增高不能預測是否并發冠狀動脈損害。

ANCA作用主要表現為介導中性粒細胞的活化、釋放活性氧、細胞因子、蛋白溶解酶等毒性介質，誘發內皮細胞損傷，導致局部血管功能異常[10，11]。近年來ANCA與KD的相關研究各家報道存在爭議[12，13]。我們結果顯示，KD急性期ANCA水平高于兩對照組，CAL組升高更明顯，CAL組血清ANCA與LCA/AAO比值呈正相關；緩解期ANCA水平降低。提示ANCA與KD病情活動有關，且在冠脈損害過程中發揮一定作用，檢測血清ANCA水平對冠脈損害的發生有預警意義。

綜上所述，MMP-9降解血管壁細胞外基質，AECA、ANCA損傷血管內皮細胞，三者均作為重要致病因素參與KD血管炎及冠狀動脈損害的發生發展；MMP-9與AECA可能通過細胞因子和炎癥細胞介導存在協同增強作用；檢測血清MMP-9和ANCA蛋白水平對于早期預測冠脈損害有一定指導價值。

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Expression of MMP-9, AECA and ANCA in peripheral blood of patients with Kawasaki disease and its relationship with coronary artery lesions

WANGXiaohua,WANGQian,ZHAOJianmei

(TheAffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong226001,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the potential role and clinical significance of matrix metalloproteinase 9 (MMP-9), anti-endothelial cell antibodies (AECA) and anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA) in vasculitis and coronary artery lesions (CAL) of patients with Kawasaki disease (KD). MethodsForty-two children with KD were divided into two groups: CAL group (n=16) and non-coronary artery lesion (NCAL) group (n=26). Twenty febrile children and 15 children for selective operation were chosen as the control group. Serum levels of MMP-9, AECA and ANCA were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), fluorescence quantitative-PCR and gelatin zymography were respectively used to detect MMP-9 mRNA expression and enzyme activity. ResultsThe MMP-9 mRNA expression, protein level and enzymatic activity in the acute phase of KD patients were all higher than those in the two control groups (all P<0.01), and they were significantly higher in the CAL group than in the NCAL group (all P<0.05). Moreover, MMP-9 mRNA expression, enzymatic activity and protein level were decreased significantly in the remission phase (all P<0.01). Serum AECA and ANCA protein levels of KD patients in the acute phase were significantly higher as compared with those of the two control groups (all P<0.01). The protein level of ANCA in the CAL group was significantly higher than that of the NCAL group (P<0.01). There was a positive correlation between serum MMP-9 and AECA protein in the acute phase of KD (r=0.77, P<0.01). The serum MMP-9 and ANCA protein levels of the CAL group in the acute phase were both positively correlated with LCA/AAO ratio (r=0.57, P<0.05; r=0.88, P<0.01). ConclusionsMMP-9, AECA and ANCA are potential pathological factors in the formation of KD vasculitis and CAL. The serum level detection has a certain value for early prediction of CAL.

Key words:Kawasaki disease; matrix metalloproteinase 9; anti-endothelial cell antibody; anti-neutrophil cytoplasmic antibody; coronary artery lesions

(收稿日期：2015-11-05)

通信作者簡介：趙建美(1971-)，女，主任醫師，醫學博士，碩士生導師，主要從事川崎病發病機制及干預的研究，為江蘇省“六大人才高峰”人才、南通市“226”人才培養對象。近五年主持江蘇省衛生廳、江蘇省人力資源社會保障廳醫學項目各1項，參與國家自然科學基金面上項目1項，獲江蘇省衛生廳新技術引進二等獎2項。E-mail：zjmheart@163.com

中圖分類號：R725.4

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)05-0010-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.05.004

作者簡介：第一王曉華(1988-)，女，住院醫師，醫學碩士，主要研究方向為兒童感染及心血管疾病。E-mail：sherran004@126.com

基金項目：江蘇省衛生廳資助科研項目(H201423)；2015年度南通市市級科技計劃項目。