rh-bFGF對兔視網膜缺血再灌注損傷的保護作用及其機制

邵宏超,葛嫣然,劉巖,蘇杰,田華

(華北理工大學附屬醫院，河北唐山063000)

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rh-bFGF對兔視網膜缺血再灌注損傷的保護作用及其機制

邵宏超,葛嫣然,劉巖,蘇杰,田華

(華北理工大學附屬醫院，河北唐山063000)

摘要：目的研究重組人堿性成纖維細胞生長因子(rh-bFGF)對兔視網膜缺血再灌注損傷(RIRI)的保護作用，并探討其作用機制。方法 66只雄性體健大耳白兔隨機分為3組：A組為RIRI組(30只)、B組為RIRI+rh-bFGF組(30只)、C組為正常假手術組(6只)，A、B組按6、12、24、48、72 h 5個時間點又隨機分為5組，每組6只。造模初期，分別往A、B組實驗動物玻璃體腔內注入相同劑量的生理鹽水和rh-bFGF溶液，并分別于制模后5個時間點處死動物摘取眼球,制作視網膜標本。C組實驗動物給予前房穿刺，處死并摘除眼球。組織標本常規HE染色后觀察各組兔視網膜組織病理學變化，免疫組化法檢測c-Fos、c-Jun陽性細胞數。結果C組兔視網膜各層次清晰、細胞平行排列且形態規則，視網膜神經節細胞呈單層排列、規則，無空泡變性。A組兔視網膜出現高度水腫，層次紊亂、細胞結構疏松，視網膜神經節細胞出現空泡樣變性，神經節細胞數目減少。B組兔視網膜結構層次和細胞組織變化與A組變化大致相同，但其損害程度較A組明顯減輕。C組兔視網膜中未發現c-Fos、c-Jun表達；與A組比較，B組RIRI后5個時間點視網膜組織中 c-Fos、c-Jun陽性細胞數減少(P均<0.05)。結論 rh-bFGF對兔視網膜RIRI有保護作用，其機制可能與抑制c-Fos、c-Jun的表達有關。

關鍵詞：缺血再灌注損傷；重組人堿性成纖維細胞生長因子；視網膜；c-Fos；c-Jun；兔

以視網膜缺血再灌注損傷(RIRI)為病理生理過程的一類疾病是臨床診療過程中常見的視功能損傷性疾病，嚴重者可導致視功能不可逆性損傷[1]。目前研究認為其損害機制是多方面的[2]，作為重要的早期應答基因，c-Fos、c-Jun被認為與細胞凋亡密切相關[3]。rh-bFGF是一種具有多種生物活性的神經營養因子。最新研究表明，其能有效減少缺血再灌注后受損神經細胞的凋亡，但機制欠清楚[4、5]。本實驗通過建造兔RIRI模型，并于玻璃體腔內注射rh-bFGF后，觀察rh-bFGF對c-Fos、c-Jun表達的影響，進一步探討rh-bFGF對RIRI保護作用的可能機制。

1材料與方法

1.1材料實驗動物：66只雄性體健大耳白兔，購自本院動物中心，外眼及眼底正常者納入試驗，體質量(2.5±0.2)kg。動物飼養于相同生長環境。66只大耳白兔被隨機分為3組：A組為RIRI組(30只)、B組為RIRI+rh-bFGF組(30只)、C組為正常假手術組(6只)。A、B組按6、12、24、48、72 h 5個時間點又隨機分為5組，每組6只。主要試劑：rh-bFGF由上海西塘生物科技有限公司提供，c-Fos單克隆抗體、c-Jun單克隆抗體均由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2兔RIRI模型制備及rh-bFGF干預A、B組均制備RIRI模型。建立RIRI模型前，A組和B組分別往兔玻璃體內注射相同劑量生理鹽水和rh-bFGF溶液。RIRI模型的建立采取前房加壓灌注法：以1 g/L的烏拉坦5 mg/kg注射兔耳緣靜脈，麻醉成功后固定于實驗臺上，均選取左眼造模，A、B組給予散瞳藥散開瞳孔，準備一端連有5號頭皮針、另一端連接生理鹽水輸液瓶，將頭皮針沿角鞏膜緣處穿刺入前房，將輸液瓶高度緩慢升高使其產生16.7 kPa壓力[5]。觀察可見：球結膜、虹膜顏色變蒼白，視網膜明顯水腫且蒼白。60 min后緩慢降低輸液瓶高度至動物眼水平，此時球結膜、虹膜顏色恢復正常，視網膜血供恢復橘紅色，提示RIRI造模成功[6]。C組實驗動物給予前房穿刺，無其他操作。

1.3視網膜組織病理學變化的觀察及c-Fos、c-Jun表達的檢測 C組動物處死并摘除眼球。A、B組于制模后5個時間點處死并摘除眼球，組織標本給予行HE染色和免疫組化染色。HE染色：烘干切片，脫蠟，乙醇復水，每個濃度2 min。蘇木素染色，0.5%鹽酸乙醇分化，1%氨水泛藍，1%伊紅染色，之后乙醇脫水，各濃度2 min。二甲苯透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察兔視網膜各層組織結構變化。c-Fos、c-Jun的檢測采用SABC免疫組織化學法。切片常規脫蠟至水，然后加入H2O2滅活內源性酶，再加入山羊血清封閉液。之后順次加入一抗、二抗，SABC、DAB顯色，蘇木素輕度復染，脫水，透明，封片。顯微鏡下觀察c-Fos、c-Jun表達。每只眼球隨機選取4張不同的切片，每張切片隨機取4個不同的視野，由各視野的陽性細胞數算出平均值。

2結果

2.1兔RIRI后視網膜組織病理學變化顯微鏡下C組兔視網膜各層次清晰、細胞結構規整，呈平行排列，視網膜神經節細胞(RGC)呈單層排列、規則，無空泡變性。A組兔視網膜出現高度水腫，層次紊亂、細胞結構疏松， RGC出現空泡樣變性，神經節細胞數目減少。B組兔視網膜結構層次和細胞組織變化與A組變化大致相同，但其損害程度較A組明顯減輕。

2.2兔視網膜組織中c-Fos、c-Jun蛋白的表達詳見表1。

表1　各組兔視網膜組織中c-Fos、c-Jun陽性

注：與B組同時間比較，*P<0.05；與A、B組同時間比較，**P<0.01；與同組6 h比較，△P<0.05；與同組12 h比較，▲P<0.05；與同組24 h比較，☆P<0.05；與同組48 h比較，★P<0.05。

3討論

研究發現，RIRI可通過誘導RGC發生凋亡，繼而導致視網膜不可逆性傷害。臨床上視網膜急性缺血性疾病經過治療后，視網膜細胞在缺血損傷后再次進行再灌注，視功能未得到提高反而會進一步損害[7]。本研究結果顯示，C組兔視網膜各層次清晰、細胞結構規整、RGC呈單層排列、無空泡變性。A組視網膜出現了損傷改變，B組輕于A組。提示rh-bFGF對RIRI有保護作用。

細胞凋亡是個復雜的過程，同時受許多凋亡基因及抗凋亡基因調控[8]，其中c-Fos、c-Jun被認為是兩個重要的凋亡調控基因[9]。Otori等[10]發現細胞變性和RIRI組織中存在c-Fos、c-Jun的陽性表達。在哺乳動物中，FOS 家族(c-Fos、FosB、Fra-1、Fra-2)和JUN 家族(c-Jun、JunB、JunD) 共同組成激活蛋白1(AP-1) ，AP-1 以同源或異源二聚體的形式發揮作用[11]。生理條件下，細胞中AP-1 以同源二聚體為主發揮作用，活性表達很低；當細胞受到生理和病理因素刺激時，AP-1會以異源二聚體為主要形式發揮作用，與基因中的AP-1調節位點緊密結合并激活靶基因，參與細胞凋亡以及對細胞損傷的反應，其表達水平及活性明顯增加[12]。RIRI可激活細胞內信號轉導途徑，促進c-Jun、c-Fos基因的表達，并進一步激活AP-1，誘導執行凋亡相關酶類與蛋白的表達，最后導致細胞凋亡、解體、死亡。

rh-bFGF是一種重要的神經營養因子[13]。它與相應受體結合后，誘導內皮細胞遷移、促進毛細血管增生，形成膠原纖維；可使血管細胞快速分裂增殖，進而改善組織局部的微循環和組織的營養代謝狀況[14]。本實驗中視網膜RIRI后給予玻璃體腔內注入rh-bFGF，可使凋亡基因c-Fos、c-Jun蛋白的陽性表達下降，從而減少神經細胞凋亡數量,這可能是rh-bFGF治療RIRI的作用機制之一，為rh-bFGF能進一步應用于臨床治療視網膜缺血再灌注疾病提供了依據。

參考文獻：

[1] Wang XD, Kashii S, Zhao L, et al. Vitamin B6protects primate retinal neurons from ischemic injury[J]. Brain Res, 2002,940(1-2):36-43.

[2] 趙成,游志鵬.視網膜缺血再灌注損傷的治療進展[J].國際眼科雜志,2007,7(2):475-477.

[3] Smeyne RJ, Vendrell M, Hayward M, et al. Continuous c-fos expression precedes programmed cell death in vivo[J]. Nature, 1993,363(6425):166-169.

[4] 曾環想,張宏波,黃凱,等.堿性成纖維細胞生長因子的藥學研究進展[J].中國新藥雜志,2010,19(11):949-952.

[5] 王小兵,王曉健,張寶林.不同濃度的重組人堿性成纖維細胞生長因子對離體人表皮細胞增殖的影響[J].中國藥物與臨床,2008,8(12):969-970.

[6] Foulds WS, Johnson NF. Rabbit electroretinogram during recovery from induced ischaemia[J]. Trans Ophthalmol Soc U K, 1974,94(2):383-393.

[7] 劉朋朋,張琦.外源性H2S預處理對大鼠RIRI細胞凋亡的影響[J].國際眼科雜志,2012,12(1):33-35.

[8] Miyaki K, Matsubara A, Nishiwaki A, et al. Pitavastatin attenuates

中圖分類號：R774

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)01-0038-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.01.013

基金項目：唐山市科技計劃項目(12140209A-45)。