二甲雙胍對人子宮內膜癌細胞增殖的影響及其機制

王夢瑩，秦淑蘭，賴曉陽

(南昌大學第二附屬醫院，南昌330006)

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二甲雙胍對人子宮內膜癌細胞增殖的影響及其機制

王夢瑩，秦淑蘭，賴曉陽

(南昌大學第二附屬醫院，南昌330006)

摘要：目的探討二甲雙胍對人子宮內膜癌細胞系Ishikawa 細胞增殖的影響及可能的作用機制。方法 以不同濃度(0、1、5、10 mmol/L)的二甲雙胍作用于Ishikawa 細胞分別干預24、48、72 h，采用MTT法檢測細胞增殖率；干預48 h后，采用RT-PCR技術檢測雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和DNA損傷反應調節基因(REDD1)mRNA的表達，Western blotting技術檢測mTOR和REDD1蛋白的表達。結果二甲雙胍抑制子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖，呈濃度時間依賴性(P均<0.05)。二甲雙胍增加REDD1蛋白及基因的表達，降低mTOR蛋白及基因的表達(P均<0.05)。結論 二甲雙胍可能通過REDD1/mTOR信號通路抑制子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖。

關鍵詞：子宮腫瘤；二甲雙胍；雷帕霉素靶蛋白；DNA損傷反應調節基因；細胞增殖

子宮內膜癌是發生于子宮內膜的一組上皮性惡性腫瘤，好發于圍絕經期和絕經后女性。在我國，子宮內膜癌的發病率逐年上升,并且呈年輕化趨勢,居女性生殖系統惡性腫瘤的第2位。目前流行病學證據表明，腫瘤的發生率與糖尿病以及某一特定糖尿病風險因素、糖尿病治療有關[1]。二甲雙胍作為治療糖尿病的一線藥物，具有抗腫瘤的多種生物活性，目前受到人們的廣泛關注。新的ORIGIN研究證明胰島素并沒有致腫瘤的作用[2]，但是對二甲雙胍抗腫瘤的作用目前仍沒有統一說法[3]。2013年11月~2014年10月，本實驗以體外培養的人子宮內膜癌Ishikawa 細胞作為研究對象，探討不同濃度的二甲雙胍對細胞增殖及雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、DNA損傷反應調節基因(REDD1)表達的影響。

1材料與方法

1.1材料人子宮內膜癌Ishikawa 細胞購自南京凱基生物有限公司。RPMI1640培養基購于索萊寶科技有限公司；胎牛血清購于長城生物科技有限公司；二甲雙胍由百時美施貴寶公司贈予；MTT試劑盒、Western blotting法試劑購于南京凱基生物科技有限公司；GAPDH鼠mAb、mTOR 兔 pAb、REDD1兔 pAb、山羊抗鼠 IgG、山羊抗兔 IgG購于proteintech公司；mTOR及REDD1擴增引物序列購于南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.2細胞培養及藥物干預Ishikawa細胞培養于RPMI1640培養基中，內含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/L、谷氨酸鹽2 mmol/L。37 ℃、5% CO2條件下2~3 d換液1次，達匯片后按5×105/瓶接種于25 cm2培養瓶。干預前用無血清RPMI1640洗2次，先用含0．1%牛血清白蛋白的無血清RPMI1640培養基培養48 h，進行分組，分別為二甲雙胍1、5、10 mmol/L組和對照組(二甲雙胍濃度為0 mmol/L)，以等體積無血清RPMI1640培養基替代二甲雙胍進行干預。

1.3細胞增殖率的測算采用MTT法。收集對數期細胞，以5×103/孔接種于96孔板，每組設5個復孔，邊緣孔用無菌PBS填充，37 ℃、5% CO2孵育。二甲雙胍分別干預24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續培養4 h(注意避光)。終止培養，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床上低速振蕩10 min。于波長490 nm處測量各孔的吸光度值。細胞增殖率=[(實驗孔A值490-空白孔A值490)/(對照孔A值490-空白孔A值490)]×100%。

1.4細胞mTOR、REDD1 mRNA的檢測采用RT-PCR法。按照TRIzol操作說明方法提取細胞總RNA。目的基因和內標基因GAPDH的反應均在ABI PRISM 7300 Fast Real-Time PCR System 上進行。mTOR擴增序列上游引物5′-CGCTGTCATCCCTTTATCG-3′,下游引物5′-ATGCTCAAACACCTCCACC-3′。REDD1擴增序列上游引物5′-TGGGCAAAGAACTACTGCG-3′, 下游引物5′-AGAGTTGGCGGAGCTAAACAG-3′。GAPDH擴增序列上游引物5′-CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGT-3′，下游引物5′-GATTTTGGAGGGATCTCGCT-3′。PCR反應體系20 μL:Mix 10 μL，PCR Forward Primer(10 μm) 1 μL, PCR Reverse Primer(10 μm) 1 μL,cDNA樣本 2 μL,RNageFree dH2O 6 μL。兩步法PCR反應條件：37 ℃逆轉錄15 min，85 ℃、5 s；94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火 30 s；72 ℃延伸 30 s，33個循環；72 ℃總延伸 8 min。應用Image J軟件進行分析。

1.5細胞mTOR、REDD1蛋白的檢測采用Western blotting法。收集對數期的Ishikawa細胞，以2×105/孔接種于6 cm培養皿，不同濃度的二甲雙胍作用48 h后收集細胞，提取細胞總蛋白，BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。配制不同濃度的分離膠(GAPDH和REDD1用10%的分離膠，mTOR用8%的分離膠)，PBS調整蛋白濃度使之一致后加入蛋白上樣緩沖液煮沸5~10 min，上樣。進行SDS-PAGE凝膠電泳，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V，電泳至溴酚藍剛離開分離膠即終止電泳，根據蛋白相對分子質量Marker切膠，制成海綿墊、濾紙、目的凝膠、PVDF膜、濾紙、海綿墊“三明治”進行轉膜，250 mA恒流轉膜80 min。WB封閉液室溫封閉1 h，加一抗稀釋液4 ℃孵育過夜，加相應HRP標記的二抗

稀釋液室溫孵育1 h。滴加ECL發光試劑至PVDF膜表面，曝光、定影X線片后，應用Image J軟件對X光片電泳條帶斑點密度掃描的灰度值進行分析。

2結果

2.1各組不同時間細胞增殖率的比較不同濃度的二甲雙胍干預人子宮內膜癌Ishikawa 細胞24、48、72 h后，細胞生長受到明顯抑制，隨著二甲雙胍濃度的增加，細胞增殖率有降低的趨勢，10 mmol /L的二甲雙胍抑制細胞增殖作用最強(P均<0.05)。見表1。

表1　各組不同時間細胞增殖率的比較±s)

注：與對照組同時間比較，*P<0.05；與二甲雙胍1 mmol/L組比較，#P<0.05；與二甲雙胍5 mmol/L組比較，ΔP<0.05。

2.2各組REDD1、mTOR mRNA及蛋白表達的比較 見表2。

表2 　各組REDD1、mTOR mRNA及蛋白表達的比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與二甲雙胍1 mmol/L組比較，#P<0.05；與二甲雙胍5 mmol/L組比較，ΔP<0.05。 3討論

眾所周知，糖尿病的發病率逐年增高，糖尿病與腫瘤之間的關系也成為研究熱點。一些研究證實，乳腺癌、胰腺癌、結直腸癌、子宮內膜癌等惡性腫瘤在2型糖尿病患者中的風險增加，且死亡風險高于非糖尿病患者[4~7]。有研究表明，二甲雙胍作為一種廣泛的抗糖尿病藥物，可以降低糖尿病患者的癌癥發病率[8]，并在動物模型中抑制癌細胞增殖和腫瘤生長[9~11]。二甲雙胍引起前列腺癌細胞周期G0~G1期阻滯，但并不會引起細胞凋亡或自噬[10]。在分子水平，二甲雙胍調節AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)/mTOR通路[12]。mTOR可以促進耗能的細胞進程并控制細胞生長。由于AMPK的激活抑制耗能通路和蛋白合成[13]，二甲雙胍可以通過AMPK來抑制細胞增殖。相反，若下調AMPK并不會影響二甲雙胍在前列腺癌細胞生長和mTOR通路抑制中的作用[10]。

REDD1(RTP801/Dig2/ DDIT4)被認為是低氧誘導因子1靶基因，參與細胞生長調節[14]。在缺氧環境下REDD1失活，細胞增殖增強，在一些腫瘤中REDD1下調[15]。REDD1是mTOR的負調節蛋白[16]，在調節mTOR和線粒體活性，抑制腫瘤發生的過程中起關鍵作用[17]，其與細胞凋亡有關[14]。有研究報道，二甲雙胍可以增加REDD1的表達。

本研究結果提示,二甲雙胍在體外可以抑制人子宮內膜癌細胞的增殖，且抑制程度隨二甲雙胍濃度增加、作用時間延長而呈增強趨勢。二甲雙胍能明顯上調REDD1的表達，同時下調mTOR的表達。提示二甲雙胍可能通過REDD1/mTOR信號通路抑制子宮內膜癌細胞增殖。

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(收稿日期：2015-06-23)

中圖分類號：R737.33

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)01-0027-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.01.009

通信作者：賴曉陽(E-mail:laixyang60@sina.com)