乳腺癌組織中Cbl-b和Itch蛋白的表達變化及意義

韓明強，李建輝，閆靜波,劉澄湘,崔占斌

(河北醫科大學附屬邢臺市人民醫院，河北邢臺054000)

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乳腺癌組織中Cbl-b和Itch蛋白的表達變化及意義

韓明強，李建輝，閆靜波,劉澄湘,崔占斌

(河北醫科大學附屬邢臺市人民醫院，河北邢臺054000)

摘要：目的觀察Cbl-b和Itch蛋白在乳腺癌組織中的表達變化并探討其意義。方法 選擇116例乳腺癌患者術后標本和30例乳腺癌患者癌旁正常乳腺組織(距癌組織邊緣5 cm)，應用免疫組化法檢測Cbl-b和Itch蛋白的表達情況，并分析其與臨床病理特征的關系。結果116份乳腺癌組織中Cbl-b和Itch蛋白的陽性表達率分別為78.45%(91/116)、58.62%(68/116)，30份癌旁正常乳腺組織中Cbl-b和Itch蛋白的陽性表達率分別為26.67%(8/30)、23.33%(7/30)。乳腺癌組織的表達均高于癌旁正常乳腺組織(P均<0.01)。Cbl-b、Itch蛋白表達與浸潤深度、淋巴結轉移及病理分期均呈正相關(r分別為0.172、0.119、0.117，0.145、0.134、0.138；P分別為0.014、0.022、0.017，0.028、0.027、0.025)；Cbl-b和Itch蛋白陽性表達與患病年齡、病灶大小無相關性(P均>0.05)。結論 乳腺癌組織中Cbl-b蛋白、Itch蛋白表達均升高，此二者參與乳腺癌的進展。

關鍵詞：乳腺腫瘤；Cbl-b蛋白；Itch蛋白

Cbl-b和Itch蛋白均屬于E3泛素連接酶家族，其通過調控免疫轉導通路中一系列信號蛋白，誘導T細胞免疫無反應性，在腫瘤免疫和自體免疫性疾病中起著重要的負性調節作用[1]。研究表明，Cbl-b和Itch基因缺陷能顯著促進T淋巴細胞活化，減少外周調節性T細胞增殖浸潤，消除腫瘤免疫耐受微環境，增強機體抗腫瘤免疫殺傷力，因此以Cbl-b和Itch為靶向的腫瘤免疫治療具有良好的應用前景[2]。目前國內外未見Cbl-b及Itch蛋白在乳腺癌組織中表達的報道。2010年3月~2014年6月，我們利用免疫組化法檢測兩種蛋白質在乳腺癌組織中的表達情況，并分析其與乳腺癌臨床病理特征的關系，旨在探討Cbl-b和Itch蛋白在乳腺癌組織中的表達變化及其臨床意義。

1資料與方法

1.1臨床資料收集本院行手術切除的116例乳腺癌患者的癌組織標本，符合衛生部2011年8月12日正式發布的《乳腺癌診斷》標準(WS338-2011)，均經病理檢查確診。病理類型均為乳腺浸潤性導管癌，臨床病理資料完整，術前未予以新輔助化療。患者均為女性，年齡28～72歲、中位年齡53歲。參照美國癌癥聯合會2010年TNM分期標準[3]，其中T1期8例，T2期34例，T3期49例，T4期25例；發生淋巴結轉移90例，N1期32例，N2期45例，N3期13例；病理分期：Ⅰ期23例，Ⅱ期33例，Ⅲ期39例，Ⅳ期21例。116例乳腺癌患者中，選擇其中的30例患者距癌組織邊緣5 cm的正常乳腺組織作為對照。

1.2組織中Cbl-b和Itch蛋白的檢測采用免疫組化法。 實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。用已知陽性對照片作為陽性對照，磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照。兔抗人Cbl-b和鼠抗人Itch單克隆抗體均購自美國BD公司，SABC檢測試劑盒和DAB顯色液均購自上海生物工程技術服務有限公司。判斷標準：Cbl-b和Itch蛋白均以細胞膜和(或)細胞質中出現棕黃色顆粒為陽性細胞染色，陽性細胞計數百分比≤10%判定為陰性，﹥10%判定為陽性，判定表達程度以陽性細胞計數百分比為參考，<25%為+，25%~50%為++,51%~75%為+++，﹥75%為++++。-為陰性，+為弱陽性，++為中度陽性，+++～++++為強陽性。

1.3統計學方法采用SPSS15.0統計軟件。計數資料以頻數或百分比表示，Cbl-b和Itch蛋白表達與臨床病理參數關系采用χ2檢驗，與參數間相關性采用Pearson相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1Cbl-b和Itch在乳腺癌組織中的表達116份乳腺癌組織中Cbl-b和Itch蛋白陽性表達率分別為78.45%(91/116)和58.62%(68/116)，30例癌旁正常乳腺組織中Cbl-b和Itch蛋白陽性表達率分別為26.67%(8/30)和23.33%(7/30)，兩種蛋白在乳腺癌組織中的陽性表達率均顯著高于癌旁正常乳腺組織(P均<0.01)。

2.2Cbl-b和Itch蛋白表達與乳腺癌臨床病理參數的關系見表1。

表1　Cbl-b和Itch蛋白表達與乳腺癌臨床病理參數的關系[例(%)]

2.3相關性分析Cbl-b表達與浸潤深度、淋巴結轉移及病理分期均呈正相關(r=0.172，P=0.014；r=0．119，P=0.022；r=0.117，P=0.017)；Itch蛋白表達與浸潤深度、淋巴結轉移及病理分期均呈正相關(r=0.145，P=0.028；r=0.134，P=0.027；r=0.138，P=0.025)。

3討論

乳腺癌屬于臨床常見惡性腫瘤，據統計資料顯示，乳腺癌發病率和病死率占美國全部女性惡性腫瘤總數的第1位，約41%[4]。過去認為乳腺癌屬于非免疫源性腫瘤，對免疫治療無明顯效果。隨著對乳腺癌發病機制研究的深入，證實乳腺癌在分子水平上存在免疫抑制狀態[5]。研究[6]表明，乳腺癌組織內細胞毒性T淋巴細胞對腫瘤組織的滲透活性及殺傷能力明顯減弱，而Treg細胞等免疫抑制細胞活性增強，兩者均構成乳腺癌免疫耐受基本要素。

Cbl-b和Itch蛋白是外周T細胞耐受的關鍵調節因子，在T細胞活化信號轉導中具有廣泛負調控作用。Cbl-b介導磷酸肌醇激酶催化亞基泛素化，改變其細胞內定位，阻斷其與細胞膜表面分子CD28和T細胞受體結合，抑制核轉錄因子活化，從而最終影響CD8+T淋巴細胞活化增殖[7]。同時，Cbl-b基因敲除CD8+T細胞對由Treg細胞和TGF-β介導的免疫抑制作用不敏感[8]，因此通過抑制或敲除Cbl-b基因能產生有效的抗腫瘤免疫治療作用。Itch在調節TGF-β信號和轉錄因子Foxp3在CD4+T細胞的表達中起著關鍵作用，Foxp3+Treg細胞能增強TGF-β的免疫抑制作用，Itch缺陷能顯著影響TGF-β依賴的轉錄因子Foxp3表達，并解除TGF-β依賴的T細胞增殖抑制作用[9]。以上研究均提示Cbl-b和Itch蛋白參與機體抗腫瘤免疫的發生發展過程。

乳腺癌的發生、發展、侵襲和轉移的過程受多種因素的共同影響，而免疫因素就是其中的關鍵環節。腫瘤局部浸潤、淋巴結轉移及乳腺癌組織學分級均與乳腺癌患者預后呈負相關。乳腺癌細胞能誘導機體免疫耐受，逃避免疫監視，最終形成腫瘤轉移，而Cbl-c、Cbl-b蛋白能介導乳腺癌在體內的侵襲轉移[10]。Yan等[11]利用蟾毒靈降低Cbl-b表達可以明顯增強腫瘤壞死因子的凋亡誘導配體功能，后者能誘導乳腺癌細胞凋亡，提示Cbl-b表達與乳腺癌細胞凋亡呈負相關。Kang等[12]研究證實，降低Cbl-b蛋白表達可顯著增強TGF-β轉錄活性，而后者可促進乳腺腫瘤生長。同樣，Itch在調節TGF-β信號轉導中起關鍵作用，但目前尚未見Itch與乳腺癌生長及浸潤轉移相關報道。國內有研究證實，Cbl-b蛋白在非小細胞肺癌組織中陽性細胞率達84.0%[13]，在胃癌組織中陽性細胞率為82.3%[14]，且發現Cbl-b蛋白高表達與腫瘤的侵襲和發展有關。本研究結果表明，與正常乳腺組織相比，Cbl-b和Itch蛋白在乳腺癌組織中均高表達，并與腫瘤浸潤程度、淋巴結轉移和病理分期呈正相關，提示Cbl-b和Itch蛋白參與乳腺癌的進展。

總之，在乳腺癌組織中Cbl-b和Itch蛋白表達均升高，此二者與乳腺癌的進展有關，有可能成為乳腺癌新的腫瘤分子標志物；但本研究仍有不足之處，包括樣本量不足、缺乏無病生存期和總生存期等長期臨床隨訪資料，有待繼續完善資料后研究證實。

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Expression changes of Cbl-b and Itch in breast carcinoma and the clinical significance

HanMingqiang,LIJianhui,YANJingbo,LIUChengxiang,CUIZhanbin

(XingtaiPeople'sHospitalAffiliatedtoHebeiMedicalUniversity，Xingtai054000，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression changes of Cbl-b and Itch in the breast carcinoma tissues and the clinical significance．MethodsThe expression of Cbl-b and Itch in 116 specimens of breast carcinoma and 30 specimens of normal breast tissues was detected by immunohistochemistry．Meanwhile, we also statistically analyzed its relationship with the clinical and pathological factors. ResultsThe positive expression rates of Cbl-b and Itch in the breast carcinoma tissues were respectively 78.45% (91/116) and 58.62% (68/116).The positive expression rates of Cbl-b and Itch in the normal tisseus were 26.67%(8/30) and 23.33%(7/30)．The positive expression rates of Cbl-b and Itch in the breast cancer tissues were higher than those of the normal tissues (all P<0.01).The positive expression of Cbl-b and Itch was positively correlated with depth of invasion, lymph node metastasis and TNM staging (r=0.172，P=0.014； r=0．119, P=0.022； r=0.117，P=0.017; r=0.145，P=0.028； r=0.134，P=0.027； r=0.138，P=0.025). The positive expression of Cbl-b and Itch was not related with age of patient and the lesion size (all P>0.05)．ConclusionThe expression of Cbl-b and Itch is increased in the breast cancer tissues, and both of them take part in the progress of breast carcinoma．

Key words:breast neoplasms; Cbl-b protein；Itch protein

(收稿日期:2015-06-09)

中圖分類號：R737.9

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)01-0015-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.01.005

作者簡介：第一韓明強(1974-),男,副主任醫師，主要從事乳腺、甲狀腺疾病的基礎與臨床研究。E-mail:hanmingqiang@126.com

基金項目：河北省衛生和計劃生育委員會2015年度醫學科學研究重點課題(20150176)。