利用基因芯片法檢測鳥分枝桿菌

史新輝,王 芳,龍宇鵬，方 麗

鳥分枝桿菌病是由鳥-胞內分枝桿菌復合體(Mycobacteriumaviumcomplex,MAC)[1]感染引起的人獸共患性傳染病,早期癥狀不明顯,多是發展到中后期通過胸部X光片或CT檢查才被發現[2]。目前,臨床多采用抗酸染色、培養法來檢測[3]。抗酸染色操作簡便,但靈敏度不高,不能鑒定細菌種類,只能作為初篩手段；培養法可以進行鑒定及藥敏試驗,是目前微生物鑒定的最有效和常用的方法。但分枝桿菌培養一般需要7～14 d才可出結果,容易延誤臨床診斷。與培養法相比,基因芯片法[4]檢測時間短、通量高,可以將檢測時間縮短為6 h左右。因此,本研究利用PCR擴增和基因芯片方法檢測鳥分枝桿菌,現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1材料與設備 標準菌株購自上海天呈醫療有限公司,包括鳥分枝桿菌(ATCC 25291)、結核分枝桿菌(ATCC 27294)；基因芯片雜交盒、PCR擴增儀及基因芯片掃描儀(北京博奧生物有限公司),N-乙酰-L-半胱氨酸(美國SIGMA公司),引物及探針合成(上海生工生物公司),細菌DNA提取試劑盒、PCR擴增試劑及基因芯片雜交試劑(北京博奧生物有限公司),分枝桿菌快速變色液體培養基(廣州凱升生物科技有限公司)；CO2培養箱(美國SHELL/B公司)。

1.2標本采集 痰液標本來源于2012年9月～2013年12月本院95例疑似分枝桿菌屬感染患者。

1.3基因芯片檢測

1.3.1PCR引物、探針的設計與合成 設計軟件:Primer Premier 5。設計遵循以下原則:引物與非特異性序列的同源性不要超過70%或有連續6個互補堿基同源；Tm值接近72 ℃；引物自身及引物之間不互補,避免3′端的互補重疊。設計出的PCR引物交由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3.2細菌DNA提取 痰液標本中加入1～2倍標本體積的稀釋液,振蕩15～20 s,室溫放置15 min；組織標本:加入能完全浸沒組織標本的稀釋液,振蕩15～20 s,室溫放置24 h。取痰液底層1.5 ml至EP管中,每個標本平行3份。12 000 r/min離心5 min,棄上清。取第1份,加入1 ml蒸餾水；剩余2份均加入200 μl蒸餾水,用加樣槍吹吸2次后,移入第1份EP管中,12 000 r/min離心5 min,棄上清。加入80 μl核酸提取試劑,放入核酸快速提取儀,振蕩5 min；移入核酸提取管后,于95 ℃水浴5 min取出,5000 r/min離心1 min。

1.3.3PCR擴增 PCR擴增體系:10×buffer 2 μl；0.2 μM dNTP 2 μl；Taq酶 0.5 μl；10 μM primer(F+B)2 μl；DNA模板 2 μl；蒸餾水13.5 μl(總體積20 μl)。PCR擴增條件:94 ℃,5 min；(94 ℃,30 s；50 ℃,30 s；72 ℃,40 s)循環40次；72 ℃,7 min。

1.3.4探針雜交 6 μl PCR擴增產物與9 μl雜交緩沖液混合,94 ℃解鏈5 min,立即置入冰盒中冷卻3 min；用微量移液器吹吸2次混勻。經雜交盒蓋片的加樣孔加入13.5 μl的雜交反應混合物。取10 μl含相應探針的雜交液滴于芯片上。蓋上雜交盒并密封,放入50 ℃預熱的恒溫水浴鍋,水浴120 min。取出芯片,用平衡至室溫的芯片洗液Ⅰ在恒溫搖床上以80～100 r/min的轉速洗滌3 min。然后用芯片洗液Ⅱ在同樣條件下洗滌3 min，以800 r/min的轉速離心5 min。

1.3.5基因芯片檢測 使用LuxScan 10K-B微陣列芯片掃描儀對甩干后的芯片進行掃描,通過軟件判讀結果,采集圖像并分析檢測報告。

1.4細菌培養法檢測 取痰液標本2 ml,加等量2%～4%的NALC-NaOH消化液,振蕩30 s,室溫放置15 min；加入pH 6.8的PBS緩沖液至45 ml,混勻；以10 000 r/min離心10 min,傾去上清液；洗滌沉淀1次。接種0.1 ml于分枝桿菌快速變色液體培養基中,37 ℃培養1～6 w。結果判斷:接種后第1 w每天觀察,當培養基顏色變紫色或紫紅色,或底層有紫色顆粒狀沉淀時,取培養基1滴于載玻片上,抗酸染色；如發現抗酸桿菌,報告陽性；再通過Vitek-Ⅱ細菌培養鑒定儀鑒定到菌種。陰性則繼續培養,直到第6 w,培養基仍沒有變紫色或紫紅色,培養瓶底層也沒有紫色顆粒狀沉淀,則報告“未培養出分枝桿菌”。

1.5統計學方法 采用SPSS18.0軟件分析,數據采用株和百分率表示,率的比較采用χ2檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。以培養法為參考方法,比較基因芯片檢測的靈敏度、特異性及與培養法檢測結果的符合度。

2 結果

2.1PCR擴增引物的設計 通過篩選,選擇鳥分枝桿菌IS1245特異序列(GenBank:L33879.1)為靶基因,Primer Premier 5.0軟件設計PCR擴增引物,并已在NCBI/BLAST檢索其特異性,符合設計要求。引物設計結果見表1。

表1 鳥分枝桿菌PCR擴增引物設計

2.2基因芯片檢測 檢測結果顯示(圖1),基因芯片檢測方法能夠對鳥分枝桿菌進行特異性檢測,對呼吸道感染中常見的干擾菌均無擴增,表明該檢測方法有較好的特異性。

圖1 鳥分枝桿菌的基因芯片檢測結果

2.3兩種方法檢測結果比較 以細菌培養法為參考方法,培養法檢出鳥分枝桿菌5例,基因芯片檢測出4例,基因芯片法的靈敏度為80.0%；培養法檢出其他菌株及陰性樣品89例,基因芯片檢出陰性88例,特異性為98.9%；基因芯片法與培養法的總體符合率為97.9%,兩種方法的檢測符合率無顯著性差異(P>0.05,表2)。

表2 兩種方法檢測結果比較(例)

3 討論

人感染MAC后,可侵害多種組織器官,包括肺、骨髓和淋巴結等,引起相應的組織器官感染[5]。鳥分枝桿菌的快速檢測,對預防及治療鳥分枝桿菌病都有重要意義[6]。但分枝桿菌生長緩慢,用傳統診斷技術周期長、敏感性低、容易延誤患者病情的診斷[7],因此,研究快速檢測鳥分枝桿菌的方法十分必要。

基因芯片技術由于同時將大量探針固定于支持物上,可以一次性對大量樣品序列進行檢測和分析,從而解決了傳統核酸印跡雜交技術操作繁雜、自動化程度低、操作序列數量少、檢測效率低等不足。與傳統檢測方法相比,基因芯片法檢測時間短、通量高[8]。

本研究采用鳥分枝桿菌IS1245特異序列為靶基因,Primer Premier 5.0設計PCR引物,并在NCBI中檢索了特異性,在此基礎上進行基因芯片法檢測,并與目前臨床上常用的細菌培養法進行了比較。結果發現,以細菌培養法為參考方法,基因芯片靈敏度為80.0%,特異性為98.9%,總體符合率為97.9%,兩種方法無顯著性差異(P>0.05)。本次研究結果表明,基因芯片檢測鳥分枝桿菌的方法,靈敏度高、特異性好,與細菌培養法結果一致,檢測周期短(1～2 d),有望用于鳥分枝桿菌的臨床快速檢驗。

【參考文獻】

[1] Ohara N,Ohara-Wada N,Kitarua H.Analysis of the genes encoding the antigen 85 complex and MPT51 fromMycobacteriumavium[J].Infection and Immunity,1997(9):3680-3685.

[2] Kim TS,Koh WJ,Han J.Hypothesis on the evolution of cavitary lesions in nontaberculous myeobaeterial pulmonarty infection:thin-section CT and histopathologic correlation[J].American Journal of Roentgenology,2005,184(4):1247-1252.

[3] 段鴻飛,土井敦生,李琦.鳥分枝桿菌復合群對16種抗感染藥物藥敏試驗的分析[J].中華結核和呼吸雜志,2010(5):359-362.

[4] Jack PJM,Amos-Ritchie RN,Reverter A.Microarray based detection of viruses causing vesicular or vesicular-like lesions in livestock animals[J].Veterinary Microbiology,2009,133(1-2):145-153.

[5] Marras TK,Wallace RJ Jr,Koth LL.Hypersensitivity pneumonitis reaction toMycobacteriumaviumin household water[J].Chest,2005,127(2):664-671.

[6] 中華醫學會結核病學分會.非結核分枝桿菌病診斷與處理指南[J].中華結核和呼吸雜志,2000(11):650-653.

[7] Griffith DE,Brown-Elliott BA,Langsjoen B.Clinical and molecular analysis of macmlide resistance inMyeobacteriumaviumcomplex lung disease[J].American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine,2006(8):928-934.

[8] 崔振玲,景奉香,胡忠義.基因芯片檢測結核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥性研究[J].中華結核和呼吸雜志,2004(7):439-441.