一株豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定

沈美艷　孫秋艷　王傳春　（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院　山東 濰坊　261061）韓鳳福　（山東省高唐縣畜牧水產(chǎn)局）

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一株豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定

沈美艷孫秋艷王傳春（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院山東 濰坊261061）
韓鳳福（山東省高唐縣畜牧水產(chǎn)局）

摘要從藍(lán)耳病疑似患豬病料中分離到一株豬繁殖與呼吸綜合征病毒。試驗(yàn)采用細(xì)胞培養(yǎng)、RT-PCR、免疫熒光技術(shù)等進(jìn)行病毒的分離和鑒定。結(jié)果表明：Marc145細(xì)胞接種出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，毒價(jià)為5.5×105 TCID50/mL, RT-PCR擴(kuò)增出特異性長度為559bp的DNA片段，用PRRSV N 蛋白單克隆抗體為一抗，羊抗小鼠IgG-FITC為二抗進(jìn)行免疫熒光檢測，檢測到接種病毒的Marc145細(xì)胞中特異性熒光信號(hào)。說明該分離株為豬繁殖與呼吸綜合征病毒。

關(guān)鍵詞豬繁殖與呼吸綜合征免疫熒光檢測RT-PCR

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiretory syndrome, PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一種接觸性傳染病。以母豬發(fā)熱、厭食、懷孕后期發(fā)生流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎、死胎、弱仔等為主要臨床特征，仔豬表現(xiàn)為呼吸道癥狀和高死亡率。1987年在美國首先發(fā)現(xiàn)該病，我國于1996年首次分離到該病毒。2006年以來，該病毒的變異株在我國出現(xiàn)，引起高致病性藍(lán)耳病，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的損失。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)屬于動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬成員。有囊膜，單股正鏈RNA。PRRSV有歐洲型和美洲型兩個(gè)基因型，二者的基因組和抗原性差異很大，但引起相似的癥狀。我國分離株為美洲株，其中引起高致病性藍(lán)耳病的的毒株為基因變異株。本研究對(duì)疑似藍(lán)耳病的病料進(jìn)行病毒的分離，經(jīng)RT-PCR、病毒培養(yǎng)特征免疫熒光技術(shù)等檢測，證實(shí)為豬繁殖與呼吸綜合征病毒。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本2011年學(xué)院動(dòng)物醫(yī)院病例。患豬體重30-50Kg,厭食，精神沉郁，體溫高、眼睛流淚，眼臉?biāo)[、咳嗽、氣喘，有的豬只腹部皮膚發(fā)紅，耳朵發(fā)紺。剖檢淋巴結(jié)腫大，棕褐色，肺臟紅褐色花斑狀。

1.1.2試劑及儀器Marc145細(xì)胞由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)贈(zèng)送，本實(shí)驗(yàn)室保存；PRRSV N蛋白單克隆抗體由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧所豬病室贈(zèng)送；羊抗小鼠IgG-FITC、胰蛋白酶、DMSO為Invitrogen產(chǎn)品；新生牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司，RT-PCR試劑盒購自青島立德生物有限公司，磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氯化鉀等為國產(chǎn)分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1病料采集和處理剖檢疑似PRRS病例，無菌采集病豬的氣管和肺臟組織。病料剪碎，按1:5加入滅菌生理鹽水，勻漿，凍融3次，4℃10000r/min離心20min，收取上清液，過濾除菌，作為RT-PCR檢測和病毒分離培養(yǎng)用樣品。

1.2.2電泳、觀察反轉(zhuǎn)錄PRC(RT-PCR)提取核酸，42℃反轉(zhuǎn)錄40min (RT buffer Mix 14.5Ul,M-MLV 1μl，Primer 1.5μl，模板核酸3μl)，為cDNA；然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR buffer Mix 26.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，模板2μl，primer 1μl)94℃預(yù)變性5min；變性20s，55℃退火40s，72℃延伸40s，30個(gè)循環(huán)，72℃終延伸5min。取PCR產(chǎn)物8ul在2%瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.2.3病毒的分離鑒定在6孔細(xì)胞板上用含10%新生牛血清的EMEM將Marc145細(xì)胞培養(yǎng)至單層，將細(xì)胞培養(yǎng)液置換成維持液，RT-PCR檢測陽性的樣品過濾除菌后0.1ml接種于Marc145細(xì)胞單層，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，觀察CPE。出現(xiàn)PRRSV典型CPE(細(xì)胞變圓、皺縮、聚堆、折光性增強(qiáng))的樣品，以RT-PCR驗(yàn)證。將第6代細(xì)胞分離毒在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行病毒滴度測定，根據(jù)Reed—Munch法計(jì)算分離毒TCID50。

1.2.4免疫熒光檢測(IFA)（1）將Marc145細(xì)胞在12孔板上進(jìn)行爬片培養(yǎng)，形成細(xì)胞單層后換成維持液，并接種0.1MOI PRRSV，病毒接種后30h，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS小心沖洗3次，加入甲醇/丙酮液固定。將爬片取出,進(jìn)行免疫熒光檢測。（2）方法：加PRRSV N蛋白單克隆抗體，37℃作用1～2h，PBS洗滌5次；滴加羊抗小鼠IgGFITC，37℃避光作用1～2h，PBS洗滌5次；用OLYMPUS倒置熒光顯微鏡觀察。

2　結(jié)果

（1）病料處理后的樣品，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，紫外檢測，觀察到目的條帶，見圖1。（2）對(duì)PCR陽性的病料用Marc145細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至第二代出現(xiàn)典型CPE，見圖2。并以RT-PCR進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證。（3）以PRRS N蛋白單克隆抗體為一抗，以羊抗小鼠IgG-FITC為二抗進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下，樣品接種組觀察到細(xì)胞中明顯的熒光，對(duì)照組沒有觀察到熒光。見圖3。

圖1　疑似PRRS病料PCR檢測結(jié)果

圖2　Marc145細(xì)胞CPE

圖3　免疫熒光檢測(PRRSV N-蛋白單抗為一抗, 羊抗小鼠IgG-FITC為二抗)

3　小結(jié)與討論

病料RT-PCR檢測結(jié)果、Marc145細(xì)胞上形成的CPE、免疫熒光檢測結(jié)果證實(shí)所分離的病毒為PRRSV，命名為SD16株。豬繁殖與呼吸綜合征在豬場廣泛存在，豬只發(fā)病導(dǎo)致直接經(jīng)濟(jì)損失巨大，而免疫抑制和持續(xù)感染狀態(tài)的存在也給免疫和凈化帶來很大困難。在綜合防控方案中，對(duì)于疑似病例的及時(shí)準(zhǔn)確的診斷十分重要。PCR檢測是目前較快速的診斷方法之一，在對(duì)臨床病例的診斷中，結(jié)合臨診癥狀、病例變化可做成較為準(zhǔn)確的判斷。但因PCR操作環(huán)境可能受氣溶膠污染等因素的影響，也需考慮PCR 結(jié)果的特異性問題。因此，在臨床診斷的基礎(chǔ)上，PCR檢測、細(xì)胞培養(yǎng)和IFA檢測相結(jié)合，可從病毒生長、免疫、基因等不同特征對(duì)分離的病毒進(jìn)行鑒定，為豬場PRRS的長期防控方案提供更準(zhǔn)確有力的數(shù)據(jù)支持。

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畜牧生產(chǎn)

收稿日期：（2016–01–04）

基金項(xiàng)目：科技部國家級(jí)星火計(jì)劃，項(xiàng)目編號(hào)：2011GA740034

中圖分類號(hào)：S858.28

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-1733(2016)01-0005-02