單克隆抗體依那西普融合蛋白的活性結構保護

潘　琦，李代禧，郭柏松，楊春生，楊　智

( 1.上海理工大學食品科學與工程研究所，上海200093;2.上海東富龍科技股份有限公司凍干工藝研究室，上海201108)

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單克隆抗體依那西普融合蛋白的活性結構保護

潘琦1，李代禧1，郭柏松2，楊春生2，楊智2

( 1.上海理工大學食品科學與工程研究所，上海200093;
2.上海東富龍科技股份有限公司凍干工藝研究室，上海201108)

摘要采用拉伸模擬和傘狀采樣的方法，利用Gromacs軟件和Amber99sb-ildn分子力場研究了不同濃度的海藻糖體系和海藻糖-甘露醇復合體系中單克隆依那西普融合蛋白二聚體的解離過程.結果表明，海藻糖能顯著增強依那西普二聚體活性結構的穩定性，且海藻糖-甘露醇的復合保護優于海藻糖的單一保護;保護劑的種類及其選擇性吸附保護的特定位置對依那西普蛋白二聚體活性結構保護效果的影響顯著.

關鍵詞依那西普;拉伸模擬;傘狀采樣;海藻糖

依那西普( Etanercept)是1998年由美國食品藥品監管局( FDA)批準用于類風濕性關節炎［1］、銀屑病性關節炎［2］、強直性脊柱炎［3］和幼年慢性關節炎［4］等疾病的抗體藥物.該藥物是以中國倉鼠細胞表達系統產生的人腫瘤壞死因子( TNF-α)受體P75與IgG Fc段結合的二聚體融合蛋白，由931個氨基酸組成，相對分子質量為1. 5×105［5］.其作用機制是通過與TNF-α競爭性結合，抑制其生物活性，從而阻斷TNF-α介導的細胞反應［6］.

市售的依那西普一般為無菌、白色、不含防腐劑的凍干粉末，其儲存溫度為2～8℃，溶解后應立即使用;如果未立即使用，應將溶解后的依那西普注射液貯存于2～8℃，最長可保存6 h.依那西普抗體蛋白復溶后的穩定性差，容易分解成單體.

在惡劣條件下，為穩定抗體藥物分子的活性結構，通常會加入一些糖類保護劑，如海藻糖( THL)、蔗糖( SUC)、甘露醇( MAN)和山梨醇( SOR)等作為輔料［7］，但保護機理尚不清楚.為此，本文以依那西普為研究對象，以海藻糖和甘露醇為保護劑，研究了低溫下保護劑對單克隆抗體融合蛋白活性結構的保護作用與規律，分析了不同保護劑的保護效果和作用機理，以期為抗體蛋白輔料配方的篩選和優化提供技術支持.

1　實驗部分

1.1結構準備

采用上海理工大學計算生物學實驗室的五舟高性能服務器集群作為高性能并行計算的計算平臺.集群共有24個計算節點，每個計算節點有2顆Intel XeonE5-2650處理器( 2. 0 GHz，每顆8核心).

選擇依那西普晶體結構( PDB ID: 2DTQ)溶劑化后的模型作為保護體系的初始模型.其晶體結構由X射線衍射分析得到，分辨率為0. 2 nm，獲取地址為http: / /www.rcsb.org/pdb/files/2dtq.pdb.結構［圖1( A)］尾部2個單體由3個二硫鍵相連，通常二硫鍵易發生可逆氧化還原反應，屬于氧化還原保護.因此，在建模處理時剔除了二硫鍵相連的部分.保護劑海藻糖［圖1( B)］和甘露醇［圖1( C)］的晶體結構采用Gaussion09軟件包在B3LYP/6-31G*方法下進行結構優化，優化后的結構為最終結構［8］.

Fig.1　Sketch of monoclonal antibody fusion protein etanercept( A) and the structure of trehalose( B) and mannitol( C)

1.2計算過程

利用Gromacs4.6生物大分子模擬軟件［9］采用拉伸模擬( SMD)［10～12］和傘狀采樣( US)［13，14］方法，在恒溫恒容條件下完成保護劑對依那西普融合蛋白的保護過程.在研究海藻糖單一保護時，不同體系中的海藻糖按線性增加的趨勢添加，而復合保護中保護劑的比例參考糖和多元醇結合的依那西普穩定配方專利［15］，每個體系的組成如表1所示.其中依那西普采用Amber99sb-ildn分子力場［16］，海藻糖和甘露醇采用Amber通用分子力場［17］，水分子采用TIP3P模型［18］.范德華力和靜電相互作用的截距分別設為1. 4和1. 0 nm，為了修正范德華力的遠程相互作用，將鄰近作用半徑設為1. 0～1. 4 nm.另外，在模擬中采用Particle Mesh Ewald( PME)方法［19］用于靜電相互作用的修正.

Table 1　Models for simulation and the detail components

首先，建立20. 2825 nm×10. 2579 nm×7. 8697 nm的周期性體系.每個體系分別進行0. 2 ns的結構最小化，再以LINear Constraint Solver( LINCS)方法［20］限制所有化學鍵的鍵長，利用Maxwell分布方法［21］設置體系各原子的初始速度，并通過Velocity-rescale方法［22］控制體系的溫度為300 K，耦合常數為0. 1，同時采用Berendsen方法［23］設定體系的壓強耦合常數為0. 5.對水溶液體系進行0. 5 ns升溫模擬［24］和5 ns的預平衡，再平衡40 ns，得到均勻穩定的依那西普融合蛋白的水溶液體系.然后設定時間步長為1 fs，拉伸速率為0. 5 nm/ns，簡諧力常數為1000 kJ/( mol·nm2)，在恒溫恒容條件下進行x軸方向的拉伸解離.根據拉伸解離的軌跡，每隔0. 1 nm提取1個體系構象，每個體系提取100個體系構象.針對每個構象分別進行傘狀采樣模擬，利用加權直方圖分析方法( WHAM)［25］得到依那西普融合蛋白二聚體的合理Potential of Mean Force( PMF)解離自由能［26］.

2　結果與討論

2.1海藻糖和甘露醇在依那西普蛋白表面的吸附作用

海藻糖是一種優良的生物活性穩定劑.從溶液結構上看，在添加有依那西普融合蛋白的海藻糖均勻溶液中，經過系統平衡后，海藻糖分子會自動吸附在依那西普抗體的蛋白表面，以實現其穩定和保護蛋白活性結構的功能.

通常，形成有效氫鍵的最大距離是0. 35 nm，能夠發生較強分子間庫侖作用和范德華力的最長距離分別是1. 00和1. 40 nm.基于此，分別統計了各體系中距離依那西普蛋白表面0. 35，1. 00和1. 40 nm范圍內吸附的保護劑分子數目，如圖2所示.

在海藻糖單一保護體系中，厚度為0. 35 nm保護劑層內的保護劑分子與蛋白表面有直接作用，其吸附效果和數目對蛋白藥物活性結構的保護起著重要作用.由統計數據可知，各模擬體系中保護層內保護劑的數目變化不大，平均吸附分子個數僅為16個.這說明大部分蛋白表面直接被水分子占據.而在復合保護體系中，該層吸附海藻糖分子10個，甘露醇分子17個，共27個保護劑分子與蛋白表面直接作用.復合保護體系中直接吸附的保護劑分子數目和蛋白表面都明顯增加，致使復合保護效果得到有效提高.

Fig.2　Numbers of protection in different thickness of protective layer around atanercept in each systema-f respectively represents the etanercept solvation systems with 50，100，150，200，250 and 300 molecular numbers of trehalose.g-t and g-m respectively represents trehalose and mannitol in complex protection system.

在厚度為1. 00 nm保護層內的保護劑分子數目隨著保護劑的添加呈現先增大后穩定的趨勢;而在厚度為1. 40 nm保護層內的保護劑分子數目隨著保護劑添加數量的增加而增大.此結果表明，不同厚度的保護層可容納的保護劑分子數目有限.

在海藻糖-甘露醇復合保護體系中，距離依那西普蛋白1. 00～1. 40 nm范圍內的2種保護劑的吸附量基本相當，海藻糖和甘露醇分子的平均吸附個數分別是81和91.復合保護體系中，120個海藻糖分子和112個甘露醇分子的總吸附量比加入250個海藻糖分子單一保護體系的吸附量多，進一步表明復合保護的優勢.

在不同保護劑濃度的依那西普溶液體系中，保護劑分子對抗體蛋白表面的選擇性吸附情況如圖3所示.可知，大量的保護劑分子可以直接或間接地吸附在依那西普抗體的蛋白表面.在海藻糖單一保護的體系中，隨著海藻糖的添加，保護劑分子對抗體蛋白的吸附面積逐漸增加［圖3( A)～( D)］.當添加的海藻糖較多時，海藻糖分子會在抗體蛋白部分表面產生聚集［圖3( E)和( F)］，而不是全面吸附和覆蓋在整個蛋白表面.說明保護劑在蛋白藥物分子表面的吸附保護是有區域選擇性的.

Fig.3　Regional selective adsorption of protectant onto the surface of etanercept in different systems( A)—( F) represent the etanercept solvation systems with 50，100，150，200，250 and 300 molecular numbers of trehalose.( G) is trehalose and mannitol complex protection system.Closed electrostatic potential surface: etanercept; green: trehalose; cyan: mannitol.In order to show clearly，the molecular of water in systems is removed.

當用海藻糖和甘露醇對依那西普進行復合保護時，由于2種保護劑在蛋白表面的選擇性吸附區域不同，會交叉協同地吸附在蛋白表面［圖3( G)］，因此吸附面積更大，分子間的相互作用會更強，實驗結果表明其保護效果也更好［27］.

2.2依那西普融合蛋白二聚體在不同體系中的穩定性

依那西普融合蛋白二聚體在不同溶液體系中解離時2個單體間拉力隨著解離時間的變化曲線見圖4，2個單體間最大拉力的柱形圖見圖5.由圖5可知，與未加保護劑的體系相比，在加入保護劑的溶液體系中依那西普蛋白解離所需的最大拉力明顯增大.這表明添加的海藻糖對依那西普蛋白二聚體活性結構的穩定性起到了保護效果.在海藻糖單一保護的溶液體系中，隨著海藻糖的加入，2個單體解離所需的最大拉力增加，表明抗體蛋白的穩定性隨著保護劑的增加而增大.在加入200個海藻糖保護劑分子(即海藻糖的質量分數為6. 86%)之后，2個單體解離所需的最大拉力不再明顯增加，這一趨勢與厚度為1. 00 nm保護層內的保護劑分子吸附個數隨著保護劑添加量的變化趨勢一致.此結果表明，海藻糖保護劑的添加基本達到了保護效果的上限，繼續添加海藻糖不能提升保護效果.

Fig.4　Curves of the pull force for dissociating etanercept dimer in different systems

Fig.5　Maximum pull force for dissociating etanercept dimer in different systems.THL-0; a.THL-50; b.THL-100; c.THL-150; d.THL-200; e.THL-250; f.THL-300; g.THL-MAN.

將海藻糖單一保護與海藻糖-甘露醇復合保護相比，依那西普蛋白二聚體在復合保護體系中解離所需的最大拉力明顯高于單一保護體系，表明復合保護效果要優于單一保護效果.這是因為在海藻糖單一保護時，與抗體蛋白有效作用范圍內的保護劑分子數目有限所致.當保護劑與蛋白表面殘基的直接保護作用達到飽和時，繼續增加保護劑的數目，保護劑則會在抗體蛋白部分表面聚集，使保護劑層增厚，保護劑對抗體蛋白的間接保護作用開始顯現，但保護效果不再明顯提高.但是在復合保護時，2種保護劑的分子結構和大小存在差異，保護劑會交叉和協同地吸附在抗體蛋白表面，選擇性吸附的面積同樣增大，保護劑與抗體蛋白表面直接作用的殘基數增加，因而復合保護效果明顯強于單一保護效果.

2.3依那西普蛋白二聚體在不同保護體系中的PMF解離自由能

依那西普蛋白二聚體在不同保護體系中的PMF解離自由能變化圖和平均PMF解離自由能分別示于圖6和表2.

Fig.6　PMF free energy of etanercept dimer during dissociation in different systems

由圖6可知，在海藻糖單一保護體系中，隨著海藻糖的添加，依那西普蛋白二聚體的解離自由能逐漸提高，與解離所需最大拉力的變化趨勢一致，但是在超過了150個海藻糖分子添加量的體系中(即海藻糖保護劑的濃度為5. 16%)，依那西普抗體的PMF解離自由能出現一個平臺，這表明海藻糖對于依那西普抗體的有效保護存在最佳濃度范圍.

由表2可知，添加海藻糖保護的依那西普的PMF解離自由能明顯高于參照體系，表明海藻糖能顯著提高依那西普蛋白二聚體的熱力學穩定性，起到保護依那西普活性結構的效果.而從復合保護體系的PMF解離自由能來看，復合保護的依那西普蛋白二聚體的熱力學穩定性反而降低，這可能是由于在復合保護中，在有效保護范圍內的保護劑中約1/2為甘露醇，并且甘露醇對依那西普蛋白二聚體的熱力學穩定性的影響作用不大.

Table 2　Average PMF free energies and errors in etanercept dissociation in different systems

在添加了200個海藻糖分子的單一保護體系中，依那西普蛋白二聚體的解離自由能反而明顯下降，可能由于保護劑在依那西普蛋白二聚體分子表面的吸附位置不同所致.

2.4保護劑的吸附位置對依那西普蛋白二聚體解離自由能的影響

為了探究依那西普蛋白二聚體在添加了200個海藻糖分子的溶液體系中解離自由能不增反降的原因，進一步分析了保護劑的吸附位置對依那西普蛋白二聚體解離自由能的影響.在海藻糖單一保護體系和海藻糖-甘露醇復合保護體系中，保護劑在距離依那西普抗體表面0. 35 nm范圍內的吸附情況如圖7所示.可見，每個體系中保護劑可以吸附在抗體蛋白2個單體相互接觸的界面處或吸附在抗體蛋白單體分子表面.當保護劑吸附在2個單體相互接觸的界面處時，對二聚體穩定性影響最佳.在添加200個海藻糖分子的體系中海藻糖雖然吸附在抗體蛋白的表面，但并未有效吸附在2個單體之間接觸的部位［圖7( D)］，導致其PMF解離自由能無明顯提高.

Fig.7　Adsorption of protectant within the range of 0. 35 nm from etanercept dimer surface( A)—( F) represent the etanercept solvation systems with 50，100，150，200，250 and 300 molecular numbers of trehalose.( G) is trehalose and mannitol complex protection system.Dimer with scarlet and indigo: etanercept; green: trehalose; cyan: mannitol.In order to show clearly，the molecular of water in systems is removed.

另外設計了200個海藻糖保護體系，在此體系中依那西普2個單體之間的交界處有海藻糖的吸附，并通過相同計算加以驗證.將海藻糖吸附在2個單體的界面處［圖8( A)］，其平均解離自由能得到明顯提高［708. 85 kJ/mol，見圖7( B)］.比第一個體系( 333. 20 kJ/mol)提高約375. 65 kJ/mol.可見，保護劑的吸附位置顯著影響依那西普抗體蛋白的熱力學穩定性.

Fig.8　Effect of trehalose adsorptive location on the structural stability of etanercept dimer( A) Adsorption of trehalose within the range of 0. 35 nm from the etanercept dimer surface;( B) PMF free energy of etanercept dissociation in new system.

在海藻糖-甘露醇復合保護體系中，在吸附依那西普抗體2個單體相接觸界面上較多的保護劑是甘露醇而不是海藻糖［圖7( G)］.為考察在關鍵吸附位置保護劑的種類對依那西普抗體蛋白熱力學穩定性的影響，將依那西普抗體2個單體交界處換為海藻糖［圖9( A)］，用相同方法計算得到新復合保護體系中依那西普的平均解離自由能值為593. 97 kJ/mol［圖8( B)］.與未更換保護劑種類前相比( 518. 97 kJ/mol，表2)，解離自由能提高約75 kJ/mol.在厚度為0. 35 nm的吸附保護層中，海藻糖與甘露醇的吸附分子數目分別是11和18個，與第一個復合保護體系相比，海藻糖與甘露醇的吸附數目均有所增加.這表明保護劑的種類和在抗體蛋白表面的吸附位置對蛋白藥物活性結構穩定性的保護效果具有重要影響.

Fig.9　Effect of adsorptive location on the structural stability of etanercept dimer( A) Adsorption of protectant within the range of 0. 35 nm from the etanercept dimer surface;( B) the PMF free energy of etanercept dissociation in new complex system.

采用拉伸模擬和傘狀采樣方法研究不同保護體系中依那西普二聚體的解離過程可以直觀有效及定量地揭示保護劑數目、種類和吸附位置對抗體蛋白活性結構熱力學穩定性的影響.相對于解離自由能，最大解離拉力更能有效地判斷蛋白藥物活性結構的穩定性.動力學比熱力學更能有效地判斷活性結構保護劑對蛋白藥物的保護作用.同時，該理論研究結果和前期依那西普穩定配方專利［15］的實驗結果一致.上述結果表明，運用拉伸模擬和傘狀采樣方法研究結果綜合判定活性結構保護劑的保護效果是可行的.

3　結　論

將拉伸模擬和傘狀采樣方法相結合研究了不同數量的海藻糖單一保護體系和海藻糖-甘露醇復合保護體系中依那西普蛋白二聚體的解離過程.結果表明，海藻糖能保護依那西普二聚體活性結構，且海藻糖-甘露醇復合保護的效果優于海藻糖單一保護;活性結構保護劑對蛋白藥物的保護作用是通過對特定關鍵部分的選擇性非親和弱吸附作用的體現;動力學比熱力學更能直接和有效地評價與判斷活性結構保護劑對蛋白藥物的保護作用.

參考文獻

［1］Goldenberg M.M.，Clin.Ther.，1999，21，75—87

［2］Mease P.J.，Goffe B.S.，Metz J.，Vanderstoep A.，Finck B.，Burge D.J.，Lancet，2000，356，385—390

［3］Heijde D.V.D.，Silva J.C.D.，Dougados M.，Geher P.，Horst-Bruinsma I.V.D.，Juanola X.，Olivieri I.，Raeman F.，Settas L.，Sieper J.，Szechinski J.，Walker D.，Boussuge M.P.，Wajdula J.S.，Paolozzi L.，Fatenejad S.，Ann.Rheum.Dis.，2006，65( 12)，1572—1577

［4］Pirjo T.，Lindahl P.，Honkanen V.，Lahdenne P.，Kotaniemi K.，Ann.Rheum.Dis.，2007，66( 4)，548—550

［5］Goffe B.，Cather J.C.，J.Am.Acad.Dermatol.，2003，49( 2S)，S105—S111

［6］Wong M.，Ziring D.，Korin Y.，Desai S.，Kim S.，Lin J.，Gjertson D.，Braun J.，Reed E.，Singh R.R.，Clin.Immunol.，2008，126 ( 2)，121—136

［7］Feofilova E.P.，Usov A.I.，Mysyakina I.S.，Kochkina G.A.，Microbiology，2014，83( 3)，271—283

［8］Wu Y.J.，Cui Y.L.，Zheng Q.C.，Zhang H.X.，Chem.J.Chinese Universities，2014，34( 12)，2605—2611(吳云劍，崔穎璐，鄭清川，張紅星.高等學校化學學報，2014，34( 12)，2605—2611)

［9］Spoel D.V.D.，Lindahl E.，Hess B.，Groenhof G.，Mark A.E.，Berendsen H.J.C.，J.Comput.Chem.，2005，26( 16)，1701—1718

［10］Mu G.，Wilmanns M.，Schulten K.，Biophys.J.，2002，83( 6)，3435—3445

［11］Isralewitz B.，Baudry J.，Gullingsrud J.，Kosztin D.，Schulten K.，J.Mol.Graph.Model.，2001，19( 1)，13—25

［12］Shen L.L.，Shen J.H.，Luo X.M.，Cheng F.，Xu Y.C.，Chen K.X.，Arnold E.，Ding J.P.，Jiang H.L.，Biophys.J.，2003，84( 6)，3547—3563

［13］Jani V.，Sonavane U.B.，Joshi R.，J.Mol.Model.，2014，20( 6)，1—14

［14］Kim I.，Allen T.W.，J.Chem.Phys.，2012，136( 16)，164103

［15］Manning M.，Murphy B.，Etanercept Formulations Stabilized with Combination of Sugars and Polyols，UP 0101640A1，2013-04-25

［16］Lindorff L.K.，Piana S.K.，Maragakis P.，Klepeis J.L.，Dror R.O.，Shaw D.E.，Proteins: Struc.Func.＆Bioinf.，2010，78( 8)，1950—1958

［17］Hornak V.，Abel R.，Okur A.，Strockbine B.，Roitberg A.，Simmerling C.，Proteins，2006，65( 3)，712—725

［18］Price D.J.，J.Chem.Phys.，2004，121( 20)，10096—10103

［19］Wu Y.J.，Zheng Q.C.，Xu Y.，Chu W.T.，Cui Y.L.，Wang Y.，Zhang H.X.，Chem.Res.Chinese Universities，2014，30( 6)，1011—1017

［20］Lan H.N.，Wang Y.X.，Zhang M.Z.，Han W.W.，Zheng X.，Chem.Res.Chinese Universities，2013，29( 1)，139—143

［21］Thurtell J.K.，Thurtell G.W.，J.Chem.Phys.，1988，88( 10)，6641—6646

［22］Bussi G.，Donadio D.，Parrinello M.，J.Chem.Phys.，2007，126( 1)，14101—14107

［23］Waichman K.，Barmashenko B.D.，Rosenwaks S.，J.Chem.Phys.，2010，133( 8)，362—364

［24］Wang Y.H.，Li W.，Chem.Res.Chinese Universities，2005，21( 1)，73—77

［25］Souaile M.，Roux B.，Comp.Phys.Comm.，2001，135( 1)，40—57

［26］Roux B.，Comp.Phys.Comm.，1995，19( 1—3)，275—282

［27］Kumar V.，Sharma V.K.，Kalonia D.S.，Int.J.Pharm.，2009，3661( 1/2)，88—98

Active Structure Protection of Monoclonal Antibody Fusion Protein Etanercept?

PAN Qi1，LI Daixi1*，GUO Baisong2，YANG Chunsheng2，YANG Zhi2
( 1.Institute of Food Science and Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093，China;
2.Institute of Freeze-drying Technology，Shanghai Tofflon Science and Technology Co，Ltd.，Shanghai 201108，China)

Abstract The thermodynamic stability of etanercept in different concentrations of the protective agent was investigated.The approaches of umbrella sampling and steered molecular dynamic simulation were adopted to study the dissociation of dimer etanercept with Gromacs software and amber99sb-ildn united atomic force field.The results indicated that the trehalose has ability to enhance the stability of dimer etanercept，and the protective effect of etanercept with trehalose and mannitol is better than with pure trehalose.In addition，the type of protective agent and alternative specific adsorption position can impact the effect of protecting active structure of etanercept observably.

Keywords Etanercept; Steered molecular dynamic; Umbrella sampling; Trehalose

( Ed.: P，H，S，K)

?Supported by the National Natural Science Foundation of China( No.51076108)，the National Science Foundation of Shanghai，China ( No.12ZR1420400)，the Innovation Funds for International Cooperation of the Shanghai Committee of Science and Technology，China ( No.12430702000) and the Alliance Program in Shanghai，China.

基金項目:國家自然科學基金(批準號: 51076108)、上海市自然科學基金(批準號: 12ZR1420400)、上海市“創新行動計劃”國際科技合作項目(批準號: 12430702000)和上海市聯盟計劃項目資助.

收稿日期:2015-09-08.網絡出版日期: 2016-01-13.

doi:10.7503/cjcu20150695

中圖分類號O629; Q341

文獻標志碼A

聯系人簡介:李代禧，男，博士，副教授，主要從事計算生物學方面的研究.E-mail: dxli75@ 126.com