蛋清活性肽的研究進展

鄭　穎,方卿穎,佟　平,陳紅兵,3,高金燕,*

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.南昌大學食品學院,江西南昌 330047;3.南昌大學中德聯合研究院,江西南昌 330047)

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蛋清活性肽的研究進展

鄭穎1,2,方卿穎2,佟平1,2,陳紅兵2,3,高金燕2,*

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.南昌大學食品學院,江西南昌 330047;3.南昌大學中德聯合研究院,江西南昌 330047)

我國蛋品資源豐富,雞蛋蛋清不僅是優質蛋白質的來源,也是產生活性肽的原料。蛋清蛋白經不同的酶水解后產生不同活性的功能片段,比如抗氧化、調節血壓、抗凝血、抑菌、改善記憶等。文章介紹了蛋清活性肽的制備方法及活性研究現狀,論述了蛋清活性肽的未來重點研發前景,以期為后續深入的基礎研究和應用開發提供參考。

蛋清,肽,活性

生物活性肽是蛋白質中20種天然氨基酸以不同排列方式和組成構成的線性或環形肽類的總稱。一般氨基酸數目在2～20之間,分子量小于6000 u的肽段具有較好的生物活性。活性肽在完整的蛋白質結構中時沒有生物活性,只有對蛋白質進行胃腸消化、發酵或酶解等作用釋放后才可發揮一定的生理作用[1],其活性主要取決于肽段的氨基酸種類、排列方式等[2]。活性肽的來源比較廣泛,從動物或植物的蛋白質中均可獲得。植物蛋白來源主要有小麥、燕麥、豆類等,動物來源主要有牛奶、蛋類和魚類等[3]。活性肽兼具營養性和功能性,其吸收效果優于氨基酸并且安全無毒副作用,可用于食品基料、慢性疾病的預防和化妝品生產等方面,具有很好的研究價值和發展前景。

蛋清活性肽研究最早始于1995年,Fujita[4-5]等人證明了卵白蛋白的酶解產物具有抑制血管緊張素轉化酶的活性,從此開啟了人們對雞蛋蛋白活性肽的關注。蛋清中含有高達9.7%～10.6%的蛋白質以及豐富的脂質和維生素、礦物質等,其中蛋清中的卵轉鐵蛋白、溶菌酶、卵白蛋白、卵粘蛋白等結構中含有許多功能片段。蛋清蛋白酶解后產生的肽段具有優于原料蛋白質的性能和其無法比擬的生物活性[6],比如抗氧化、調節血壓、改善記憶、抑菌、緩解疲勞[7]、調節膽固醇、調節血糖[8]、抗凝血[9]、抗炎癥反應[10-11]、抗腫瘤[12]和提高免疫力,蛋清活性肽的研究將為雞蛋的開發、利用和提高附加值提供了一條有效的途徑。

1　蛋清活性肽研究現狀

1.1蛋清活性肽的制備

利用溶劑萃取、酸堿水解、酶解和生物發酵等方法都可從蛋白質中獲得生物活性肽[13]。其中酶解法是一種在不破壞蛋白質營養價值的前提下且能提高其功能性質的安全、有效方式[14],其作用條件溫和,酶解過程易控制,是目前制備蛋清活性肽最常用的方法。將蛋清蛋白稀釋至一定濃度,適當的加熱處理使蛋白質的結構松散,利于酶解。使用單酶或復合酶酶解得到酶解產物,即肽和蛋白質的混合物,然后通過調節pH或加熱方式把酶滅活。使用截留不同分子量的超濾膜,可將肽混合物根據分子量分開。為了得到純度更高、活性更強的單一肽段,可將其進行色譜分離。比如:將超濾后的某一高活性組分在離子交換色譜柱或凝膠色譜柱中分離,收集活性更高的組分,再利用反相高效液相色譜法進一步純化直到得到單個活性肽段,最后用質譜測定其氨基酸序列[15]。此外,蛋清高F值寡肽的制備同樣采用酶解法,但因其酶解物中含有大量游離芳香族氨基酸,所以要用吸附法或過濾分離法進行脫芳處理,方可獲得高F值寡肽液。

1.2蛋清活性肽的活性研究

1.2.1抗氧化肽機體新陳代謝產生活性氧(Reactive oxygen species,ROS),活性氧自由基包括超氧化物陰離子、羥基自由基、過氧化氫和一氧化氮等。糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化、癌癥等一些慢性疾病與ROS有密切的關系。ROS容易攻擊蛋白質、核酸、脂類等生物大分子加重細胞損傷[16]。抗氧化肽通過抑制或清除自由基來保護細胞和線粒體的正常結構和功能,防止脂質過氧化,從而達到預防和治療自由基誘發的慢性疾病和抗衰老的目的。目前已有從蛋清或蛋清蛋白中純化的一些具有抗氧化活性的肽段,比如YLGAK、GGLEPINFQ、SALAM、YQIGL、YRGGLEPINF、PEY、LPDE、WVE、NTDGSTDYGILQINSR[17]、LDEPDPL和NIQTDDFRT[18]等。Chang[19]等利用生物蛋白酶酶解卵粘蛋白,酶解液呈現出較強的ABST自由基清除活性;牛慧慧[20]等人使用胃蛋白酶酶解凍干的蛋清,結果表明:在1～20 mg/mL范圍內蛋清肽清除羥基自由基、超氧陰離子自由基及DPPH自由基的能力均隨著蛋清肽質量濃度的增加而增加,質量濃度為10 mg/mL時,DPPH自由基的清除率達到95.24%;Chen[21]等利用木瓜蛋白酶水解蛋清,分離純化得到兩種抗氧化肽,經LC-MS/MS鑒定其序列為YLGAK和GGLEPINFQ,化學合成這兩種肽段并測其DPPH自由基清除能力分別為粗蛋清水解液的7.48和6.02倍;Wu[15]等從蛋清粉中純化并鑒定出兩個高抗氧化活性肽段AEERYP和DEDTQAMP,其抗氧化能力指數(ORAC)為(4.35±0.09)、(3.47±0.12) μmol TE/mg,并且肽段AEERYP與先前鑒定的序列YAEERYPIL的肽段的活性相差甚微,這說明N-末端去掉Tyr,C-末端去掉Ile-Leu后對YAEERYPIL肽段的抗氧化活性沒有太大的影響,然而把肽段AEERYP中的Ala除去后其ORAC值減少到(2.21±0.04) μmol TE/mg,這預示著Ala在其抗氧化活性中起著重要作用。Tyr、Trp、Phe等氨基酸的芳香族殘基和His的咪唑基團能通過電子轉移淬滅自由基[22],Pro、Val、Ala、Leu和含硫氨基酸Met、Cys對肽的抗氧化活性形成也有很大的貢獻,比如Pro的吡咯烷環基可與肽的二級結構相互作用,由于其較低的電離勢,使其靈活性和猝滅單線態氧的能力增加,但是游離氨基酸并不能產生抗氧化活性,只有通過一定的序列結合形成肽段后才能發揮生物活性[23]。

1.2.2ACE抑制肽高血壓是一種備受全球關注的嚴重威脅人類健康的心血管疾病,目前臨床上主要靠化學藥物來治療,但其副作用大且易產生依賴性。具有降壓作用的活性肽的研發,將為預防和治療高血壓提供一種新的可能。在人體血壓調節系統中,血管緊張素轉化酶(angiotensin-I converting enzyme,ACE)起著重要作用。它是一種具有廣泛底物特異性的鋅金屬肽酶[24],能催化無升壓活性的血管緊張素I(angiotensin I,Ang I)轉化為具有收縮血管作用而致強效升壓的血管緊張素II(angiotensin II,Ang II)以及將具有血管舒張功能的舒緩激肽(Bradykinin,BK)降解為無舒張血管能力的片段[25-26]。因此,ACE在調節血壓和心血管功能的腎素-血管緊張素系統(Renin-Angiotensin System,RAS)及激肽釋放酶-激肽系統(Kallikrein-Kinin System,KKS)中起著關鍵的作用。ACE抑制劑(ACEI)作為一種與ACE活性區域結合的底物競爭性抑制劑,能阻礙AngΙ水解成AngII以及催化BK水解使之失活。Yu[27]等利用胃蛋白酶酶解蛋清得到蛋清蛋白酶解物,并分離出活性較高的血管緊張素轉移酶抑制肽。Majumder[28]等人發現用聲波或還原劑二硫蘇糖醇(DTT)預處理蛋清中的卵轉鐵蛋白后,再用嗜熱菌蛋白酶和胃蛋白酶酶解,獲得的酶解液的ACE抑制活性相比未經預處理卵轉鐵蛋白的酶解液提高了20倍,并從中分離純化出兩個五肽IRWCT、IQWCA和一個四肽LKPI。目前還有一些已報道的雞蛋來源的ACE抑制肽,比如:酶解卵白蛋白得到的FFGVRCVSP、QRKIKVYL、LW、FRAHPFL[29],酶解卵轉鐵蛋白得到的LVRQQT[30]等。通過對ACE抑制肽結構的大量研究發現N末端疏水性氨基酸如Ile、Leu、Val等,C末端含環氨基酸Pro、Trp、Tyr等對ACE的抑制活性有重要作用,比如用雞蛋卵轉鐵蛋白中的IQW和LKP對原發性高血壓小鼠進行體內實驗,能分別降低血壓19和30 mmHg[31];于志鵬利用胃蛋白酶通過交聯葡聚糖凝膠色譜純化從蛋清粉中得到RVPSL、QIGLF、TNGIIR等多個肽段,并用這三種活性肽分別對原發性高血壓大鼠(SHR)進行單次、短期和長期灌胃,都有明顯的降血壓效果并對大鼠的正常生長無不良影響。經長期灌胃RVPSL和QIGLF后大鼠的收縮壓降低至少30 mmHg[32]。

1.2.3抗凝血肽凝血是人體不可或缺的生理防御過程,在正常生理狀態下,機體內凝血系統和纖維蛋白溶解系統處于動態平衡。但是當凝血異常,特別是凝血系統亢進時,會形成血栓。血栓性疾病如心肌梗塞、肺梗塞、腦血栓、視網膜動靜脈阻塞和四肢及周圍血管栓塞等疾病發生率高居各種疾病之首,嚴重危害人類健康[32]。凝血酶是一種在凝血過程中起關鍵作用的絲氨酸蛋白酶,可作為抗凝治療的靶點,抗凝血肽可通過抑制凝血酶的活性有效阻礙凝血過程的發生[34]。Yu[35]等人從蛋清中分離純化的肽段RVPSL兼具ACE抑制、抗氧化和抗凝血三種活性,并且在胃腸道消化檢測時呈現出很好的穩定性。楊萬根[36]研究發現用Protease N酶解蛋清得到的17個抗凝血酶活性肽段中疏水性和堿性氨基酸含量很高,并且抗凝血酶活性與酶解液中氨基酸的極性和帶電荷性質緊密相關;王菲[37]采用胃蛋白酶水解蛋清液,酶解液經Sephadex G-50純化后得凝血酶抑制率為85%,IC50值為28.04 mg/mL,體外半衰期約為60 min,與臨床凝血酶抑制劑藥物相比IC50值較大、半衰期較短,但其安全性高,來源廣泛,作為預防血栓類疾病的功能食品具有很大的開發價值。

1.2.4抑菌肽抗菌肽是一類能夠抵御外來細菌或其他微生物入侵的生物活性肽,它具有熱穩定性和廣譜抗細菌活性,其作用機理普遍認為有兩種:膜結構破壞型機制和非膜結構破壞型機制。在膜結構破壞機制中,抗菌肽作用于目標菌的磷脂雙分子層,抗菌肽帶有的正電荷與脂質雙分子層表面上的負電荷相互作用,使細胞膜穿孔,形成膜通道,細胞質外溢,從而達到殺菌的目的,其中抗菌肽的水脂雙親結構起到了關鍵的作用[38]。非膜結構破壞型機制中,抗菌肽破壞細胞壁、抑制DNA合成、抑制細胞呼吸等生化反應進程[39-40]。朱伶俐[41]以雞蛋溶菌酶為原料,選取金黃色葡萄球菌為實驗菌種,采用比濁法選擇胃蛋白酶,以高溫處理后的抑菌率為指標優化酶解條件,分離得到的氨基酸序列為MKRHGLDNY的肽段具有較好的耐熱性且對革蘭氏陽性菌有抗菌作用。Pellergrini[42]等用胰蛋白酶水解卵白蛋白,得到五個抗菌肽SALAM、SALAMVY、NVLOPSS、ELINSW、YPILPEYLQ,用糜蛋白酶處理得到三個抗菌肽AEERYPILPEYL、GIIRN和TSSNVMEER,通過化學合成這八種肽段,發現它們對枯草芽孢桿菌均具有很強的抑制性,對黏質沙雷氏菌、綠膿假單胞菌、支氣管炎博德特菌和大腸桿菌有一定強度的抑制性,其中TSSNVMEER和GIIRN的抑菌活性最強。鄭建[43]用胃蛋白酶在40 ℃下水解卵轉鐵蛋白2 h,分離純化得到具有抗革蘭氏陰性菌(G-)和革蘭氏陽性菌(G+)活性的肽組分,該組分對G+更敏感,其中測得對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為60 μg/mL,對大腸桿菌的最小抑菌濃度為100 μg/mL。

1.2.5改善記憶肽隨著年齡的增長,人類機體自然老化和大腦退行性疾病如阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病、多發性硬化癥等都會造成記憶下降[44]。大腦創傷和由壓力引起的失眠、抑郁、焦慮等都會對大腦造成一定損傷,導致頭痛、記憶力下降等。研究表明,記憶的下降或退化與大腦的海馬區病變、神經遞質減少以及突觸病變等有關[45]。目前雖然發現許多食源性的改善記憶活性肽,但是對其具體作用機制還未研究透徹,在蛋清改善記憶活性肽的研究方面,許海麗[46]用堿性蛋白酶和風味蛋白酶雙酶酶解蛋清蛋白粉得到蛋清高F值寡肽,用兩周齡的小鼠進行水迷宮實驗,在灌胃72 d時水迷宮所需時間最少,改善小鼠記憶效果最佳。

1.2.6高F值寡肽高F值寡肽是一類由2～9個氨基酸殘基組成的F值大于20的混合寡肽體系。F值是指混合物中支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸,簡稱BCAA)與芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸,簡稱AAA)的含量之比[47],即BCAA/AAA。高F值寡肽中富含的具有較強疏水作用的支鏈氨基酸是人體內的必需氨基酸,使得高F值寡肽在人體的生理活動中發揮多種生物活性。高F值寡肽的應用從保肝護肝、輔助性治療肝性腦病及苯丙酮尿癥延伸到解酒醒酒、抗疲勞、抑制癌細胞增殖及其他生物活性領域。目前國內有一些學者對蛋清高F值寡肽的制備技術和活性進行探討,有研究用蛋清高F值寡肽灌胃健康小白鼠,以其皮膚中羥脯氨酸含量來評價皮膚衰老的程度。結果顯示不同濃度蛋清高F值寡肽均可以明顯提高受試小鼠皮膚中羥脯氨酸含量,說明蛋清高F值寡肽在抗衰老方面也具有一定的作用[48]。

2　蛋清活性肽研發的前景展望

2.1蛋清活性肽的新活性及增效技術

雖然在蛋清活性肽的研究方面已經取得一定的成果,但除了文中所述蛋清肽的幾種活性以外,是否還有其他的功能活性有待進一步發掘。現在多用堿性蛋白酶、胃蛋白酶和風味蛋白酶等常用酶類對其進行酶解,是否還有其它一種或幾種酶能更好地作用于蛋清蛋白制備活性肽,使其產生更高的生物活性還有待進一步研究。雖然蛋清活性肽已經具有不錯的活性,但是與相關藥物相比,其活性依然有待提高。如果能通過增效技術再次增加其活性,這將會有很高的實際價值和意義。研究發現,對大豆蛋白酶解液進行類蛋白反應修飾后,ACE抑制活性顯著提高[49];更有研究[50]發現肽與肽之間或肽與非肽類等其他功效因子協同作用比單一組分具有更好的效果,這可能是因為具有不同作用機制的功效因子之間存在互補或相互修復作用。

2.2蛋清活性肽定量構效關系的研究

定量構效關系(Quantitative structure activity relationship,QSAR),是通過研究現有的活性物質,以其結構參數或理化參數為自變量,生物活性為因變量,用數學模式來表達生物活性物質的化學結構信息與特定的生物活性強度之間的關系[51]。QSAR可作為一種定量描述活性肽結構與活性關系的有效方式。在多肽的定量構效關系研究中,一般采用組成多肽的氨基酸殘基的結構參數定量描述多肽的化學結構。活性肽的定量構效關系研究是其生物活性研究至關重要的一部分,隨著藥物化學和計算化學的迅速發展,QSAR技術也在不斷更新和推進。新的QSAR研究理論也將因技術的逐步成熟而在蛋清活性肽以及其他生物活性肽領域得到充分的應用。

2.3蛋清活性肽的體內吸收和活性評價

目前對二肽和三肽在體內的完整吸收已經得到普遍的認可,但是氨基酸序列大于3的活性肽在體內的生物利用率和吸收轉化情況還需進一步驗證,也是食源性功能肽研究中一個亟待解決的問題。在活性肽的體內吸收評價方面,多用Caco-2細胞模型模擬小腸上皮細胞進行物質的吸收評價。Caco-2細胞系來源于人類結腸癌細胞,在培養條件下能自動分化成單層細胞,其結構和生化特點均類似于人類小腸上皮細胞,可用于模擬研究營養物質及藥物等在小腸上皮的吸收代謝等情況。但是Caco-2細胞由于缺乏小腸上皮中的黏液層以及細胞色素P450的一些同工酶與人體中的差異等原因,此方法也存在不足。同時一些活性肽在體外評價時活性較高,但經胃腸消化后是否保留其活性,也需要進一步驗證。未來的研究還需要在動物或人類志愿者體內進行更為詳細地研究,以便更好地了解活性肽在人體內的吸收轉化、代謝以及服用耐受量等情況。

2.4蛋清活性肽的工業化生產

現在對活性肽的研究大多是以分離純化出單個高活性肽段為主,雖然其中的科研價值不可估量,但是耗時、耗力、得率低、成本高,不利于大量制備及工業化生產。通過可控酶解、優化其工藝參數等技術大量制備出高活性蛋白水解母液或粗分離組分,更具有產品開發價值[52],使用適度的亞基解離、變性技術等對原料進行前處理和多酶偶聯控制酶解等技術對蛋清的可控酶解、高效制備都有極大地促進作用。國外現已有一些企業把乳清蛋白肽、鰹魚肽、酪蛋白肽、大豆肽作為降血壓、提高免疫力等功能性食品或食品基料進行工業化生產,國內也有企業把苦瓜肽、大豆肽、玉米肽、菜籽肽商業化生產成具有降膽固醇、促進脂質代謝和輔助降血壓等作用的功能食品和養生保健品。我國蛋品資源豐富,雞蛋產量居世界首位,可為活性肽的生產提供豐富而廉價的原材料。研究發現,用雞蛋蛋白制備活性肽活性優于乳蛋白活性肽[53]。國外已有公司分別生產出具有降血壓、治療糖尿病功能的雞蛋活性肽產品。目前國內商業化的蛋清活性肽產品還很少,將其進行工業化生產不僅能滿足現代人對綠色功能食品的需求,而且還有利于拓寬禽蛋產品市場,延伸禽蛋產業鏈,對于開發禽蛋的高附加值產品具有重要意義,其潛在的經濟價值和市場前景不言而喻。

3　結語

生物活性肽因其優質的品質和潛在功能價值引起了越來越多學者的興趣,成為國際上一個備受關注的研究領域。雞蛋清蛋白作為含有人體八種必需氨基酸的優質蛋白,是獲得優質活性肽的良好資源。利用酶解法可制備出活性強、安全性高的蛋清活性肽。蛋清活性肽作為一種兼備營養和功能價值的蛋清深加工產品,對其深入研究并應用于功能食品、化妝品或醫藥行業,將對雞蛋產業的發展以及人類的健康有極大地促進作用。

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[53]吳建平. 雞蛋中生物活性肽的機遇與挑戰[J]. 中國家禽,2012(13):39.

Advance of bioactive peptides derived from egg white

ZHENG Ying1,2,FANG Qing-ying2,TONG Ping1,2,CHEN Hong-bing2,3,GAO Jin-yan2,*

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;2.Department of Food Science,Nanchang University,Nanchang 330047,China;3.Sino-German Joint Research Institute,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

Egg is rich in resources in our country. Egg white is considered as a rich source of high quality proteins with various bioactive peptide fractions. Enzymatic hydrolysis of egg white can be used to release bioactive fractions and different enzymes have different abilities in releasing bioactive fractions,like antioxidant activity,angiotensin converting enzyme(ACE)inhibitory activity,anticoagulation properties,antimicrobial activity and improving memory ability. In order to provide the

for the related research of bioactive peptides derived from egg white,the preparation and evolution method of activity were introduced. Meanwhile,the development direction in future of egg white peptides were discussed.

egg white;peptide;activity

2016-01-28

鄭穎(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：營養與食品衛生，E-mail：13767000769@163.com。

高金燕(1967-)，女，碩士，教授，研究方向：食品營養與安全，E-mail：gaojy2013@ncu.edu.cn。

國家“863”計劃(2013AA102205)；江西省自然科學基金計劃(重點項目)(20133ACB20009)；江西省國際合作項目(20111BDH80026)；食品科學與技術國家重點實驗室目標導向課題(SKLF-ZZA-201612)。

TS253.4

A

1002-0306(2016)18-0396-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.068