GABA高產菌株的篩選、鑒定及誘變選育

鄭鴻雁，趙煒彤，昌妍希，邙巍（.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春08；.內蒙古醫科大學藥學院，內蒙古呼和浩特0000；.吉林省德惠市朱城子鎮人民政府，吉林德惠000）

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GABA高產菌株的篩選、鑒定及誘變選育

鄭鴻雁1，趙煒彤1，昌妍希2，邙巍3
（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春130118；2.內蒙古醫科大學藥學院，內蒙古呼和浩特010100；3.吉林省德惠市朱城子鎮人民政府，吉林德惠130300）

摘要：從火龍果果實表面上篩選出一株發酵產γ-氨基丁酸（GABA）白色菌株，經形態學觀察、生理生化試驗和18S rDNA測序分析，鑒定為假絲酵母菌菌株（Candida.sp），命名為C2。C2作為出發菌株，分別采用紫外線（UV）和亞硝基胍（NTG）誘變方法選育高產γ-氨基丁酸菌株。與出發菌株相比，紫外誘變菌株γ-氨基丁酸產量增加了40.25 %，亞硝基胍誘變菌株γ-氨基丁酸產量增加了62.83 %。通過紫外線和亞硝基胍復合誘變，得到正向突變株，其中Y6突變株遺傳性狀穩定，γ-氨基丁酸產量達2.561g/L，產量比誘變前提高了3.1倍。

關鍵詞：γ-氨基丁酸；假絲酵母；紫外線；亞硝基胍；復合誘變

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），又稱氨酪酸，是一種非蛋白質組成的天然氨基酸，分布非常廣泛，在動物、植物和微生物中均有GABA存在[1-3]。GABA是哺乳動物中樞神經系統一種主要的抑制性神經遞質[4]，具有許多重要的生理功能如降血壓[5]、安定神經[6]、增強記憶[7]、抗焦慮[8]，尤其對更年期的失眠、壓抑和自身失調療效顯著[9]。隨著γ-氨基丁酸的生理功能不斷研究和闡明，已經發展成為一種新型的功能性因子，正逐漸應用于醫藥、食品及農業等行業[10-12]。2009年衛生部批準γ-氨基丁酸作為新資源食品用于食品生產加工[13]。我國在GABA類食品的研究開發上與日本等發達國家相比落后很多，目前僅僅處于研究的初級階段[14]。GABA生產有化學合成法、微生物發酵法和植物富集法[15]。通過微生物發酵的方法有安全性高、生產成本較低和對環境友好的特點[16]。菌株的生產能力可通過突變方式大幅度提高。相比單獨一種誘變方法，復合誘變能有效改變菌株對誘變因素的敏感性，提高正向突變率，具有大規模提高生產菌株產量的潛力[17-18]。

本研究從火龍果表皮分離篩選出一株GABA較高產亮的C2菌株，經鑒定為假絲酵母（Candida.sp）。通過紫外線和亞硝基胍對其進行復合誘變，選育出一株遺傳性能穩定的高產γ-氨基丁酸酵母菌菌株，對于γ-氨基丁酸的發酵生產具有重要的實際意義。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

菌株來源：從草莓、火龍果、葡萄等水果表皮分離篩選能產生GABA的酵母菌菌株。

1.1.2培養基

1）酵母合成培養基：葡萄糖20 g，酵母提取物5 g，蛋白陳10 g，瓊脂粉20 g，水1 000 mL，pH 6.0。2）PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，水1 000 mL，pH 6.0。3）發酵培養基：葡萄糖30 g，NaNO33 g，酵母提取物1 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，蒸餾水1 000 mL，L-谷氨酸5 g，pH 6.0。4）種子培養基：葡萄糖50 g，蛋白胨5 g，酵母膏1 g，KH2PO41 g，FeSO4·H2O 0.01 g，MgSO4·H2O 0.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0。

1.1.3主要儀器及試劑

UV-1700型紫外可見分光光度計：日本島津；Z-36HK型高速低溫冷凍離心機：德國HERMLE；標準γ-氨基丁酸：上海楷洋生物技術有限公司；亞硝基胍：日本東京化成工業株式會社；LC-20A型高效液相色譜儀（SPD-20A紫外檢測器，LC-20AT泵，CTO-10AS VP柱溫箱，LC-solution工作站）：日本Shimadzu。

1.2方法

1.2.1產GABA菌株篩選

將各種樣品稀釋涂布于酵母合成培養基上，28℃培養48 h，挑取單菌落劃線純化得到酵母菌純菌株，進行編號。將菌株接入發酵培養基進行發酵培養，用薄層層析法篩選出產GABA菌株。再通過反相高效液相色譜法進行GABA定量測定，挑選出一株高產GABA菌株，進行鑒定。

1.2.2產GABA菌種鑒定方法

根據形態學、生理生化及分子生物學方法對高產GABA的菌株進行鑒定。將菌株接種于PDA固體培養基上，28℃培養3 d，觀察菌落形態，美藍染色，在光學顯微鏡下觀察其菌體形態，參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》對菌株進行鑒定[19]。分子生物學鑒定：18S rDNA測序（上海生工生物工程公司）；運用BLAST搜索同源序列，應用Mega5.3建樹，鑒定菌株。

1.2.3 γ-氨基丁酸定性測定

采用薄層層析法。按0.4 %的比例將顯色劑茚三酮加入展開劑中，展開劑組成體積比為：正丁醇∶冰醋酸∶水= 4∶2∶1。將發酵液5 000 r/min離心15 min取上清液同1 g/L標準γ-氨基丁酸溶液點樣，展開后80℃顯色20 min。

1.2.4 γ-氨基丁酸含量的測定

用鄰苯二甲醛（OPA）柱前衍生紫外檢測反相高效液相色譜測定發酵液中GABA含量。液相色譜條件：色譜柱：Venusil-AA氨基酸分析專用柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm）。流動相：流動相A為25 mmol/L的乙酸鈉，用4 %的乙酸調pH至5.90；流動相B為純乙腈。流速為1 mL/min，梯度洗脫程序如表1所示，柱溫40℃，進樣量20 μL，檢測波長：332 nm。取發酵液5 000 r/min離心15 min取上清液，稀釋到一定濃度。發酵液20 μL于樣品瓶中，加入OPA衍生液100 μL，渦旋振蕩5 s，靜置2 min后，過0.45 μm濾膜，取20 μL進樣。定量采用GABA標準曲線，方程為Y=8.9E+7X+1155.9，回歸系數R2=0.999 8。采用HPLC檢測GABA所得的峰面積，根據標準曲線換算成GABA產量。梯度洗脫程序見表1。

表1梯度洗脫程序表Table 1 Gradient elution program

1.2.5菌懸液的制備

將在種子培養基中28℃恒溫培養至對數生長期的菌體離心收集，并用0.9 %的無菌生理鹽水洗滌3次，重懸于生理鹽水中，調整菌液濃度約為108CFU/mL，制成菌懸液[20]。

1.2.6紫外誘變

紫外燈預熱30 min后，取5 mL菌懸液放置在培養皿中，并將其放入磁力攪拌器上，在20 W紫外燈下距離20 cm照射一定時間。然后用無菌水稀釋成10-4、10-5、10-6濃度，分別取0.1 mL涂平板。將涂好的平皿置于28℃的恒溫恒濕培養箱中避光培養72 h，培養好后從平板上挑取長勢良好的菌株，進行發酵培養，并測定其γ-氨基丁酸產量。采用3輪照射法進行誘變。每次試驗測定結果都采用3個平行組，測試結果為各重復樣的平均值。

1.2.7亞硝基胍誘變

取一定量的菌懸液，加入0.8 mg/mL亞硝基胍溶液。28℃下分別振蕩反應5、10、15、20、25、30 min。立即于5 000 r/min室溫離心10 min。取沉淀用PBS洗滌3次后，溶于無菌水中，各取0.1 mL菌懸液進行稀釋分離，涂布于PDA培養基平板上，28℃培養72 h，計算致死率。在確定了NTG處理時間后，再取菌懸液0.5 mL分別用濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL的亞硝基胍溶液28℃下振蕩，計算致死率，確定NTG的最佳濃度。從平板上選取長勢較好的菌株，進行發酵培養，測定γ-氨基丁酸產量。每次試驗測定結果都采用3個平行組，測試結果為各重復樣的平均值。

1.2.8復合誘變

先將菌懸液在20 W紫外燈下距離20 cm照射一定時間，然后將誘變后的菌液用一定濃度的亞硝基胍28℃處理一定時間。將亞硝基胍處理過的菌體離心，用PBS沖洗3次以除去殘留的亞硝基胍，然后使菌體轉移到100 mL種子培養基中28℃培養24 h，最后將菌懸液稀釋到合適稀釋度，涂布于平板上，28℃培養72 h，計算致死率。從平板上選取長勢較好的菌株，進行發酵培養，測定γ-氨基丁酸產量。總共進行3輪復合誘變。每次試驗測定結果都采用3個平行組，測試結果為各重復樣的平均值。

致死率的計算如下公式：

1.3遺傳穩定性實驗

選取誘變后得到的γ-氨基丁酸產量較高的變異菌株連續傳代8次，每代分別進行搖瓶發酵培養，測定其含量，含量穩定的則其遺傳性能穩定。

2結果與分析

2.1產GABA菌株的篩選

通過酵母合成培養基分離培養出32株菌。通過薄層層析檢測，篩選得到產GABA菌株共有3株。選取產GABA最高含量為0.8g/L的一株菌株進行系統鑒定。圖1為發酵液中GABA薄層層析檢測結果。

圖1薄層層析檢測結果Fig.1 TLC test results

2.2產GABA菌株的鑒定

菌體形態如圖2所示，呈橢圓形，美蘭染色呈藍色。菌落形態如圖3所示，菌落表面光滑，呈乳白色。生理生化試驗結果如表2所示。通過對菌株的基因序列分析，擴增18S rDNA序列長為1 278 bp。圖4為電泳圖。在NCBI數據庫中對菌株序列進行BLAST對比，菌株與Candida. sp.同源性達100 %。建立系統發育樹如圖5所示。結合菌株形態特征以及生理學特征初步鑒定該菌為Candida.sp，命名為C2。

菌體形態如圖2所示。

圖2菌體形態Fig.2 Cell morphology

菌落形態如圖3所示。

圖3菌落形態Fig.3 Colony morphology

酵母菌C2的生理生化特征如表2所示。

表2酵母菌C2的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of C2 yeast strain

C2菌株的18SrDNA序列PCR擴增電泳圖見圖4。

圖4 C2菌株的18S rDNA序列PCR擴增電泳圖Fig.4 C2 strain PCR amplification of 18S rDNA sequences electrophoresis

C2菌株系統發育樹如圖5所示。

圖5 C2菌株系統發育樹Fig.5 C2 Strain phylogenetic tree

2.3紫外誘變最佳誘變時間的確定

紫外線照射時間對菌株的致死率關系曲線如圖6所示。

圖6紫外線照射時間對菌株的致死率關系曲線Fig.6 Lethal rate curve of the strain on UV irradiation time

從圖6可知，紫外線照射時間對菌株致死率影響較大。按照誘變劑量選擇的一般原則，采用致死率為70 %~80 %的劑量。用紫外線處理50 s時致死率為75 %，選取50 s為最佳誘變時間。

2.3.1紫外線誘變突變株的篩選

以最佳誘變劑量50 s對初始菌株作誘變處理。經初篩后，選40株突變株進行復篩，其中12株產γ-氨基丁酸的含量較高，結果見表3。

從表3可以看出，菌株UV15、UV28、UV34、UV40產γ-氨基丁酸量較高，其中UV28產γ氨基丁酸的量較原始菌株提高了40.25 %。連續傳代5次產量基本穩定，可作為下一步誘變的出發菌株。紫外誘變突變株發酵液中γ-氨基丁酸產量見表3。

表3紫外誘變突變株發酵液中γ-氨基丁酸產量Table 3 GABA production of mutant strains by UV

2.4亞硝基胍誘變誘變劑濃度的確定

不同濃度亞硝基胍誘變菌株的致死率如圖7所示。

圖7不同濃度亞硝基胍誘變對菌株的致死率關系曲線Fig.7 Lethal rate curve of the strain on NTG concentration

隨著誘變劑濃度的增大，致死率不斷上升。當亞硝基胍濃度為1.4 mg/mL時，致死率達100 %；用0.8 mg/mL亞硝基胍誘變菌株時，致死率為74 %，符合目的致死率。因此在亞硝基胍誘變中選擇亞硝基胍濃度為0.8 mg/mL。

2.5亞硝基胍誘變處理時間的確定

亞硝基胍處理時間對菌株的致死率影響見圖8。

圖8亞硝基胍處理時間對菌株的致死率關系曲線Fig.8 Lethal rate curve of the strain on Processing time by NTG

隨著誘變時間的延長，致死率不斷上升。當誘變時間為30 min時，致死率達100 %；誘變時間為15 min時，致死率為78 %。由于酵母菌的致死率為75 %~80 %時誘變作用最為明顯，菌株發生正向突變的幾率最高，因此確定亞硝基胍處理時間為15 min。

2.6亞硝基胍誘變突變株的篩選

以0.8 mg/mL的NTG為最佳誘變濃度對菌株UV28誘變處理15 min。將誘變所得的50株突變株，利用HPLC法進行測定，篩選出γ-氨基丁酸產量較高的6株突變菌，其γ-氨基丁酸含量如表4所示。

將突變株NTG17與突變株NTG20分別轉接5代，發現突變株NTG17的遺傳穩定性較好，產γ-氨基丁酸的量較突變株UV28提高了40.28 %。確定將它作為復合誘變的出發菌株。亞硝基胍誘變突變株發酵液中γ-氨基丁酸產量見表4。

表4亞硝基胍誘變突變株發酵液中γ-氨基丁酸產量Table 4 GABA production of mutant strains by NTG

2.7紫外線與亞硝基胍復合誘變的結果

以最佳紫外誘變劑量和最佳亞硝基胍誘變劑量對突變株NTG17進行3輪復合誘變，得到4株產γ-氨基丁酸量較高的菌株，結果見表5。

表5復合誘變突變株發酵液中的γ-氨基丁酸產量Table 5 GABA production of mutant strains by compound mutation

其中突變株Y6產γ-氨基丁酸的量最高，產γ-氨基丁酸的量較突變株NTG17提高了62.83 %。因此選取突變株Y6為γ-氨基丁酸的高產菌株。

2.8突變株Y6傳代試驗

對菌株Y6連續傳代培養8次，測定γ-氨基丁酸產量結果見表6。

由表6可知突變株Y6的γ-氨基丁酸產量穩定，說明該突變株Y6遺傳穩定性較好。

2.9 HPLC測定GABA結果

圖9（a）為不添加GABA的空白衍生劑色譜圖，圖9（b）為GABA標準品液相色譜圖，對比可見，GABA的保留時間為17.1 min左右。圖9（c）為發酵液色譜圖。采用HPLC檢測法可準確的測定出GABA產量。

表6突變株遺傳穩定性的測定Table 6 Genetic stability test of the mutant strain

圖9高效液相色譜圖Fig.9 HPLC chromatograms

3　結論

本研究通過初篩、復篩獲得了一株γ-氨基丁酸產量較高的菌種，采用高效液相色譜法對γ-氨基丁酸樣品進行了快速準確的定性分析，并根據形態、生理生化試驗以及18SrDNA序列分析初步鑒定出該γ-氨基丁酸高產菌株為假絲酵母Candida.sp。分別采用紫外線和亞硝基胍對C2菌株誘變，確定紫外線和亞硝基胍誘變條件為：紫外照射50 s，亞硝基胍濃度0.8 mg/mL，亞硝基胍處理時間15 min，經過多輪誘變和篩選，得到遺傳穩定性較好的Y6突變株，γ-氨基丁酸產量最高為2.561g/L，是出發菌株產γ-氨基丁酸產量的約3.1倍。目前生物合成γ-氨基丁酸的酵母菌國內外研究很少，Takahashi等從日本米酒中篩選到一株釀酒酵母，發酵液中γ-氨基丁酸濃度約為0.42 mmol/L[21]。試驗所篩選的高產γ-氨基丁酸菌株對研究γ-氨基丁酸具有重要的實踐意義，為今后研究γ-氨基丁酸保健產品提供一定的理論參考價值。

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Sceening and Indentifiacation and Mutagenesis of High-yielding Strains for Producing GABA

ZHENG Hong-yan1，ZHAO Wei-tong1，CHANG Yan-xi2，MANG Wei3
（1. Food Science and Engineering College，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，Jilin，China；2. Pharmacy College，Inner Mongolia Medical University，Huhhot 010100，Inner Mongolia，China；3. People's Government of Dehui City，Jilin Province，Dehui 130300，Jilin，China）

Abstract：White strains producing γ-aminobutyric acid（GABA）were screening from the surface of pitaya fruits. Strains named C2 were identified as Candida.sp by morphological observation，physiological and biochemical characteristics and 18SrDNA sequence analysis.C2 as the starting strain was screened by UV and NTG to get high-yield of γ-aminobutyric acid yeast. Compared with the starting strain，the data showed that the increasing rate of γ-aminobutyric acid production was 40.25 %from a strain by UV mutagenesis and 62.83 % from a strain by NTG mutagenesis.Y6 with stable γ-aminobutyric acid production was obtainded by UV combined with NTG.The γ-aminobutyric acid production from Y6 was 2.561 g/L and increased about 3.1 times than that before mutagenesis.

Key words：γ-aminobutyric acid；Candida.sp；UV；NTG；composite mutagenesis

收稿日期：2014-09-18

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.045

作者簡介：鄭鴻雁（1968—），女（漢），副教授，碩士研究生，研究方向：功能食品、微生物菌種篩選及發酵工藝。