高效液相色譜法測(cè)定多種真菌中麥角硫因含量

趙艷敏，雷智東，劉成航，劉岱琳，*（.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院生藥教研室，天津市職業(yè)與環(huán)境危害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300309；.天津科曼思特醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，天津300457）

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高效液相色譜法測(cè)定多種真菌中麥角硫因含量

趙艷敏1，雷智東1，劉成航2，劉岱琳1，*
（1.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院生藥教研室，天津市職業(yè)與環(huán)境危害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300309；2.天津科曼思特醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，天津300457）

摘要：利用HPLC法對(duì)9種醫(yī)用真菌中麥角硫因的含量進(jìn)行測(cè)定。采用Kromasil 100-5NH2色譜柱，以乙腈：5 mmol/L醋酸銨（80∶20，體積比）為流動(dòng)相，在254nm波長(zhǎng)下測(cè)定麥角硫因的含量。所用方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，測(cè)得9種真菌中麥角硫因含量范圍為0.000 0 %~0.064 1 %。9種真菌中麥角硫因的含量差異較大，其中以靈芝中含量最高，本研究為該稀有氨基酸的開(kāi)發(fā)提供了新的方向。

關(guān)鍵詞：醫(yī)用真菌；麥角硫因；高效液相色譜法；含量測(cè)定

麥角硫因（L-ergothioneine，EGT）是1909年在真菌Claviceps purpurea中首次發(fā)現(xiàn)的一種天然稀有的手性氨基酸類化強(qiáng)抗氧化劑[1]，具有抗氧化[2]、清除自由基[3]、螯合金屬離子[4-5]、防止紫外線輻射損傷[6]、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)、參與細(xì)胞內(nèi)能量調(diào)節(jié)以及細(xì)胞生理保護(hù)劑[7-8]等多種功能，是機(jī)體內(nèi)的重要活性物質(zhì)。麥角硫因以其獨(dú)特的生物學(xué)、藥理特性以及安全性、穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，在化妝品、功能食品、制藥和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[9]，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

麥角硫因在絕大多數(shù)生物體中的含量極少，而在某些真菌中含量較多[10]。我國(guó)真菌資源豐富，但目前測(cè)定麥角硫因含量的真菌種類極少，本文采用高效液相色譜法對(duì)未見(jiàn)報(bào)道的9種真菌中麥角硫因含量進(jìn)行測(cè)定，以期為麥角硫因的科學(xué)調(diào)查和真菌的進(jìn)一步合理利用提供科學(xué)參考。

1材料與方法

1.1菌種

木蹄層孔菌Fomes fomentarius、樹舌Gan-oderma applanatum（Pers. Ex Wallr）Pat.、松針層孔菌phellinuspini、云芝Coriolus versicolor、靈芝Ganoderma lucidum、樺褐孔菌Inonotus obliquus（Fr.）Pilát、硫磺菌Laetiporus sulphureus（Fr.）Murrill、粗毛褐孔菌Xanthochrous hispidus（Bull.ex-fr.）Pat.、薄皮纖孔菌Inonotus cuticularis（Bull. ex Fr.）Karst.Polyporuscuticularis （Bull.）Fr：以上真菌購(gòu)自吉林、黑龍江、天津等地。

1.2試劑與儀器

麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)品（含量98 %）：購(gòu)自天津市科曼思特醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；娃哈哈純凈水：乙腈（色譜級(jí)）：乙酸銨（試劑級(jí)）。

LC-20AT型高效液相色譜儀（自配SPD-M20A型紫外檢測(cè)器、CTO-20柱溫箱）：日本Shimadzu公司；MT5電子天平：瑞士梅特勒－托利多公司；HH－2數(shù)字顯示恒溫水浴鍋：常州市國(guó)華儀器有限公司；KQ5200E超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DHG－9000A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

精密稱取麥角硫因?qū)φ掌愤m量，置于10mL棕色容量瓶中，用色譜甲醇定容，搖勻，得標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0.112 mg/mL，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2供試品溶液的制備

稱取不同品種真菌各2.5 g于100 mL容量瓶中，加入80 mL去離子水，于100℃水浴鍋中加熱回流提取1 h，冷卻至室溫，用去離子水定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3色譜條件[11]

色譜柱：Kromasil 100-5NH2柱（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流動(dòng)相采用乙腈-5mmol /L醋酸銨（80∶20）恒流洗脫；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量20 μL。對(duì)照品及硫磺菌樣品的色譜圖見(jiàn)圖1。

1.3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、2.5、5.0、7.5mL置于10 mL容量瓶中甲醇定容至刻度，搖勻，取新配置的4種標(biāo)準(zhǔn)溶液及標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液各20 μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度X/（mg/mL）為橫坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品峰面積Y/mV為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

圖2麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of EGT

由圖2可知，麥角硫因在0.005 6 mg/mL～0.112 0 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，在此范圍內(nèi)線性回歸方程為：Y = 4.69×107X+414 056，R2= 0.999 8。

2.2方法學(xué)考察

2.2.1精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液20 μL重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定色譜峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示RSD= 0.78 %，表明在該色譜條件下儀器精密度良好。

2.2.2重現(xiàn)性試驗(yàn)

精密稱取硫磺菌樣品5份，每份2.5 g，按1.2.2項(xiàng)下方法制備待測(cè)溶液，按1.2.3項(xiàng)下方法測(cè)定麥角硫因的峰面積，計(jì)算RSD=1.15，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.2.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別于0、4、8、12、24 h精密吸取處理后的硫磺菌樣品20μL進(jìn)樣，測(cè)定色譜峰面積，計(jì)算RSD為1.21%。結(jié)果表明在24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.2.4加樣回收試驗(yàn)

取已知麥角硫因含量的硫磺菌樣品2.5 g，分別加入相當(dāng)于樣品中麥角硫因含量的80 %、100 %、120 %的對(duì)照品溶液，按1.2.2項(xiàng)下方法制備待測(cè)溶液，按1.2.3項(xiàng)下方法測(cè)定麥角硫因的峰面積，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示麥角硫因加樣回收試驗(yàn)良好。

2.3樣品水分含量測(cè)定[12]

取剪切成約0.5 cm×0.5 cm的真菌樣品各2 g，平鋪于干燥恒重的扁形稱量瓶中，精密稱定，在100℃～105℃干燥5 h。移置干燥器中，冷卻30 min，精密稱定，再在上述溫度干燥1 h，冷卻稱重，至連續(xù)2次稱重的差異不超過(guò)5 mg為止。根據(jù)減失的重量，計(jì)算樣品中的水分含量（%），平行3次，求平均值，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1麥角硫因加樣回收率結(jié)果（n=3）Table 1 The addition recovery of ergothioneine（n=3）

表2 9種真菌中水分含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Table 2 The moisture contents of nine different kinds of fungi （n = 3）

2.4樣品的測(cè)定

各樣品按1.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按1.2.3項(xiàng)下方法測(cè)定各供試品峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算供試品中麥角硫因的濃度C（mg/mL），利用計(jì)算公式計(jì)算各樣品的含量，每個(gè)樣品平行試驗(yàn)3次，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 9種真菌中麥角硫因的含量（n=3）Table 3 The contents of ergothioneine of nine different kinds of fungi（n=3）

式中：C為供試品中麥角硫因的濃度，mg /mL；V = 100 mL；M為各樣品的質(zhì)量，mg；W為各樣品的水分含量，%。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)首次采用高效液相色譜法測(cè)定了9種常見(jiàn)的醫(yī)用真菌中麥角硫因的含量，結(jié)果顯示：除粗毛褐孔菌外，其他8種真菌均不同程度的含有麥角硫因，但不同種類的真菌中麥角硫因的含量的差異較大。麥角硫因含量由高到低依次為：靈芝＞硫磺菌＞薄皮纖孔菌＞樺褐＞云芝＞松針層孔菌＞木蹄=樹舌＞粗毛褐孔菌。

麥角硫因可以由許多微生物如真菌和放線菌自身合成，存在于真菌、谷物、等多種植物體內(nèi)，尤以真菌中存在最為普遍[14]。我國(guó)真菌資源豐富，但目前國(guó)內(nèi)對(duì)麥角硫因的研究多集中于食用真菌，本文的研究為麥角硫因的開(kāi)發(fā)利用提供了新的方向。

參考文獻(xiàn)：

[1] Tanret C. Sur une base nouvelle retiree du seigle ergote, L-Ergothioneine Compt[J]. Rend Acad Sci, 1909, 149: 222-224

[2] FRANZONI F, COLOGNATO R, GALETTA F, et al. An in vitro study on the free radical scavenging capacity of ergothioneine: comparisonwithreducedglutathione,uricacid and trolox[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2006, 60(8) :453-457

[3]林陳水,付水星,黎小軍,等.一種稀有的天然氨基酸-麥角硫因[J].氨基酸和生物資源,2006,28(1):63-67

[4] SPEISKY H, GOMEZ M, CARRASCO-POZO C, et al. Cu (I) -Glutathione complex: A potential source of superoxide radicals generation[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008,16(13):6568-6574

[5]朱本占,毛莉,范瑞梅,等.天然抗氧化劑麥角硫因保護(hù)銅所致DNA和蛋白質(zhì)氧化損傷的作用機(jī)理[J].科技通報(bào),2011,56(27): 2283-2288

[6] MARKOVA N G, KARAMAN-JURUKOVSKA N, DONG K K, et al. Skin cells and tissue are capable of using L-ergothioneine as an integral component of their antioxidant defense system[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2009, 46(8): 1168-1176

[7]張萌萌,張倩,張國(guó)琛.金針菇提取液中麥角硫因氨基酸的功能及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用前景[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(11): 3385-3387,3390

[8]張翠,趙艷敏,白淑芳,等.HPLC法測(cè)定不同品種蘑菇中麥角硫因的含量[J].食品工業(yè)科技,2013,23(34):307-310

[9]李軼群,周念波.麥角硫因的生物學(xué)功能及其應(yīng)用[J].食品工程, 2010(3):26-28

[10] EY J, SCHOMIG E, TAUBERT D. Dietary sources and antioxidant effects of ergothioneine[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(16) : 6466-6474

[11]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:一部[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄52

Determination of Ergothioneine in Multiple Species of Fungi by HPLC

ZHAO Yan-min1，LEI Zhi-dong1，LIU Cheng-hang2，LIU Dai-lin1，*
（1. Tianjin Key Laboratory for Biomarkers of Occupational and Environmental Hazard，Department of Pharmacognosy，Logistics College of Chinese People's Armed Police Force，Tianjin 300309，China；2. Tianjin Chroma-standard Medical Science & Technology Development Co. Ltd.，Tianjin 300457，China）

Abstract：Ergothioneine in nine species of fungi were determined by HPLC. The samples were analyzed by kromasil 100-5 NH2column with elution（acetomitrile-5 mmol/L ammonium acetate solution（80∶20，volume ratio）as mobile phase. The detection wavelength was 254 nm. The method was simple and reliable. The contents of ergothioneine in fungi were in the range of 0.000 0 %-0.064 1 %. The hightest content occurred in lucid ganoderma. This study supplied a new train of thought to the development and utilization of ergothioneine.

Key words：fungi；ergothioneine；HPLC；contents determination

收稿日期：2014-09-12

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.029

*通信作者：劉岱琳（1973—），女（漢），教授，研究方向：天然產(chǎn)物活性成分研究。

作者簡(jiǎn)介：趙艷敏（1987—），女（漢），助教，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物活性成分研究。

基金項(xiàng)目：天津市科技支撐項(xiàng)目（12ZCZDNC01500）