HPLC法同時測定更年靈膠囊中3種成分的含量

鄒　燕,龔秋翼,趙佳麗

浙江省嘉興市食品藥品檢驗檢測院，浙江 嘉興

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HPLC法同時測定更年靈膠囊中3種成分的含量

鄒燕,龔秋翼,趙佳麗

浙江省嘉興市食品藥品檢驗檢測院，浙江 嘉興

[摘要]目的建立高效液相色譜法同時測定更年靈膠囊中淫羊藿苷、維生素B1及維生素B6的含量。方法采用高效液相方法，色譜柱：Ultimate AQ-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：0.04%庚烷磺酸鈉溶液(含0.12%的三乙胺，用冰醋酸調節pH值至3.3)(A)-乙腈(B)梯度洗脫；檢測波長：270 nm；柱溫：20 ℃；流速：1.0 mL/min。結果淫羊藿苷、維生素B1和維生素B6分別在4.052～48.624、21.63～255.12和20.50～246.00 μg/mL范圍內，與其峰面積呈良好的線性關系(r=0.999 8、1.000、1.000，n=6)。平均回收率(n=6)分別為99.37%(RSD=1.08%)、100.93%(RSD=1.70%)和99.34%(RSD=1.76%)。結論該法操作簡便，結果準確、重復性好，可用于更年靈膠囊的質量控制。

[關鍵詞]更年靈膠囊；淫羊藿苷；維生素B1；維生素B6；高效液相色譜法

0引言

更年靈膠囊作為婦女更年期綜合征的復方制劑，由淫羊藿、維生素B1、女貞子、谷維素、維生素B6組成。具有溫腎益陰、調補陰陽的功效。其質量標準收載于衛生部藥品標準中藥成方制劑第十四冊[1]或遵照國家食品藥品監督管理局標準(試行)，雖然部分藥企已經對質量控制項目做了更新及完善，但是沒有統一規范的質量標準，不利于藥品質量的監管。本文通過建立高效液相的方法，同時測定更年靈膠囊中淫羊藿主成分淫羊藿苷及維生素B1、維生素B6的含量，以達到有效控制產品質量的目的。

1儀器和試藥

1.1儀器Agilent 1260高效液相色譜儀(安捷倫公司)；XS105DU電子天平(梅特勒-托利多有限公司)；Delta320H酸度計(梅特勒-托利多有限公司)；超純水(密理博超純水器，Milli-Q)；超聲波清洗儀(USC-502，上海波龍電子設備有限公司，超聲頻率：58 kHz)。

1.2試藥淫羊藿苷對照品(批號：110737-200415，供含量測定用)、維生素B1對照品(批號：100390-200502，供含量測定用)、維生素B6對照品(批號：100116-200415，供含量測定用)，均由中國生物制品檢定研究院提供；乙腈(色譜純，德國德姆施塔市墨客股份有限公司)，水為超純水，其他試劑均為分析純。更年靈膠囊(河北百善藥業有限公司，批號：150101；通化振林藥業有限責任公司，批號：130302)。

2方法與結果

2.1溶液的制備

2.1.1對照品溶液的制備精密稱取105 ℃干燥至恒重的維生素B1對照品21.26 mg和維生素B6對照品20.50 mg，同置20 mL容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備溶液1。另精密稱取淫羊藿苷對照品10.13 mg，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備溶液2。精密量取對照品儲備溶液1、2各1 mL，同置10 mL容量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，得對照品溶液。

2.1.2供試品溶液的制備取更年靈膠囊(河北百善藥業有限公司，批號：150101)裝量差異項下內容物約0.3 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加稀乙醇約80 mL，超聲30 min，冷卻，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液。

2.1.3陰性對照溶液的制備依更年靈膠囊處方制備缺淫羊藿苷、維生素B1、維生素B6的陰性樣品，按供試品溶液制備方法配制，得陰性對照。

2.2色譜條件色譜柱：Ultimate AQ-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：0.04%庚烷磺酸鈉溶液(含0.12%的三乙胺，用冰醋酸調節pH值至3.3)(A)-乙腈(B)梯度洗脫，0~11 min A∶B(88∶12)，12~20 min A∶B(67∶33)；檢測波長：270 nm；柱溫：20 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；記錄色譜圖，見圖1，在該色譜條件下更年靈膠囊中淫羊藿苷、維生素B1、維生素B6峰與相鄰色譜峰的分離度均大于2.0，且淫羊藿苷峰理論板數不低于10 000；陰性對照溶液在此3組分保留時間處均無色譜峰出現，表明樣品中的其他組分對實驗結果無干擾。

圖1　更年靈膠囊三組分HPLC色譜圖

2.3線性關系考察取“2.1.1”項下對照品儲備溶液1、2，加稀乙醇分別制成含淫羊藿苷4.052、8.104、16.208、24.312、36.468、48.624 μg/mL，含維生素B121.63、42.52、85.04、127.56、191.34、255.12 μg/mL，含維生素B620.50、41.00、82.00、123.00、184.50、246.00 μg/mL的線性關系對照品溶液。按“2.2”項色譜條件進樣20 μL，得線性回歸方程。淫羊藿苷的回歸方程：Y=42.602 X+18.865，r=0.999 8；維生素B1的回歸方程：Y=33.054 X+4.960，r=1.000；維生素B6的回歸方程：Y=15.142 X+12.802，r=1.000。結果表明，淫羊藿苷、維生素B1和維生素B6分別在4.052～48.624、21.63～255.12和20.50～246.00 μg/mL范圍內，與其峰面積呈良好的線性關系。

2.4精密度試驗精密吸取對照品溶液20 μL，進樣6次，記錄色譜圖，計算淫羊藿苷、維生素B1、維生素B6峰面積的RSD(n=6)分別為0.1%、0.1%、0.2%，表明本方法的精密度良好。

2.5重復性試驗按“2.1.2”項方法平行制備5份供試品溶液(河北百善藥業有限公司，批號：150101)，分別進樣，記錄色譜圖，計算淫羊藿苷、維生素B1、維生素B6的平均含量(n=5)分別為5.132、34.209、31.796 mg/g，RSD分別為1.0%、1.4%、1.2%，表明本方法的重復性良好。

2.6穩定性試驗按“2.1.2”項方法制得供試品溶液(河北百善藥業有限公司，批號：150101)，分別于0、2、4、6、8 h進樣20 μL，計算淫羊藿苷、維生素B1和維生素B6峰面積的RSD(n=5)分別為0.1%、0.2%和0.1%。表明本法的供試品溶液在8 h內穩定性良好。

2.7加樣回收率取已知含量的樣品(河北百善藥業有限公司，批號：150101)約0.3 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇約40 mL，超聲30 min，冷卻，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液5 mL和“2.1.1”項對照品儲備溶液1、2各1 mL，同置10 mL容量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，得回收率試驗溶液。分別進樣20 μL，計算淫羊藿苷、維生素B1、維生素B6的回收率，結果見表1。

2.8樣品測定取2批樣品，按“2.1.2”項方法制備供試品溶液，進樣測定，按外標法以峰面積計算含量。結果見表2。

3討論

3.1本品中淫羊藿苷定量測定的方法收錄于《中國藥典》一部[2]，方法成熟，為確保更年靈膠囊的產品質量，有必要規范其淫羊藿苷的含量。目前關于更年靈膠囊中維生素B1、維生素B6含量測定的文獻較多[3-4]，實驗證明，本法中淫羊藿苷、維生素B1、維生素B6峰與相鄰峰能完全分離，且柱效高，采用梯度洗脫，不僅提高了維生素B1和維生素B6的分離度，而且加快了淫羊藿苷的出峰時間，使得3組分能用同一色譜條件加以控制，大大提高工作效能。

表1　樣品回收率試驗結果

表2　樣品測定(mg/g)

3.2超聲時間的選擇按“2.1.2”項所述方法制備3組供試品溶液，超聲時間分別選擇10、20、30 min，進樣分析，結果顯示，超聲30 min淫羊藿苷、維生素B1的含量明顯提高，故選擇30 min作為供試品制備的超聲時間。

3.3檢測波長的選擇用實驗用溶劑配制淫羊藿苷、維生素B1、維生素B6對照溶液，采用紫外分光光度計測定三組分的最大吸收波長。淫羊藿苷在270、321、350 nm處有最大吸收；維生素B1在237、262 nm波長處有最大吸收；維生素B6在209、291 nm波長處有最大吸收。綜合考慮，選擇270 nm作為檢測波長，在此波長下，淫羊藿苷、維生素B1、維生素B6均有良好峰形。

3.4流動相的選擇實驗初始選擇乙腈-0.04%庚烷磺酸鈉溶液(用冰醋酸調節pH值至3.0)，維生素B1及維生素B6的柱效不理想，后改用本方法色譜條件，峰形得到改善。

3.5柱溫的選擇實驗中分別選擇20、30、40 ℃為柱溫，進樣分析，結果在20 ℃時維生素B6峰與相鄰峰的分離度明顯提高，故選擇20 ℃作為實驗柱溫。

綜上所述，本法選定的色譜條件效率高，分離度好，柱效理想；而樣品的前處理也簡單、快速。故采用HPLC法同時測定更年靈膠囊中淫羊藿苷、維生素B1和維生素B6的含量是可行的。這也為藥品標準修訂提供了思路。

參考文獻：

[1]中華人民共和國衛生部藥品標準.中藥成方制劑[S].第十四冊,1997:64.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：中國醫藥科技出版社,2010:306.

[3]呂天姿，王雅麗，張馨木.HPLC測定更年靈膠囊中維生素B1和維生素B6的含量[J].華西藥學雜志,2007,22(3):326-327.

[4]陳珊珊，陳永紅，孫玉濱，等.反相離子對色譜法同時測定更年靈膠囊中維生素B1和維生素B6的含量[J].中國現代中藥，2007,9(1):27-29.

Determination of icariin,vitamin B1and vitamin B6in gengnianling capsule by HPLCZOU Yan，GONG Qiu-yi，ZHAO Jia-li (Zhejiang Jiaxing Institiute for Food and Drug Control，Jiaxing 314000,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish a method for simultaneous determination of icariin,vitamin B1and vitamin B6in gengnianling capsule by HPLC.MethodsThe HPLC with Ultimate AQ-C18(250 mm × 4.6 mm,5 μm) column was used,mobile phase was heptanesulfonic acid sodium salt solution (A)-acetonitrile (B) gradient elution,the detection wavelength was at 270 nm;The column temperature was 20 ℃ with the flow rate of 1.0 mL/min.ResultsThe linear range of icariin,vitamin B1and vitamin B6was 4.052~48.624 μg/mL (r=0.999 8 ),21.63~255.12 μg/mL (r=1.000) and 20.50~246.00 μg/mL (r=1.000),the recovery rates were 99.37% (RSD=1.08%),100.93%(RSD=1.70%) and 99.34%(RSD=1.76%).ConclusionThe method is simple and accurate with good reproducibility,and it can be used for the quality control of gengnianling capsule.

Key words：Gengnianling capsule;Icariin;Vitamin B1;Vitamin B6;HPLC

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201601020

收稿日期：2015-05-30