PEG化青霉素降低紅細胞溶血的研究

饒秀麗

江西濟民可信集團有限公司，南昌 102600

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PEG化青霉素降低紅細胞溶血的研究

饒秀麗

江西濟民可信集團有限公司，南昌 102600

[摘要]目的采集葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺陷的動物模型血液，評價PEG化青霉素降低紅細胞溶血的作用。方法1%乙酰苯肼皮下注射大鼠制備G6PD缺陷的動物模型，取其紅細胞制成混懸液，比較青霉素和PEG化青霉素的溶血作用，以及兩組的紅細胞脆性、紅細胞膜流動性。結果青霉素組出現明顯的紅細胞溶血，且隨著濃度變化和孵育時間延長溶血具有增加的趨勢，溶血率高達25%，而PEG化青霉素組未見明顯溶血；另外，紅細胞脆性實驗結果表明，PEG化青霉素對紅細胞膜的作用非常輕微，H50%為43.6%，顯著低于青霉素組(52.9%)；紅細胞膜流動性結果表明，PEG化青霉素對紅細胞膜的流動性影響非常輕微。結論PEG化青霉素的溶血率較低，為該藥的體內研究和進一步新型藥物制劑開發奠定基礎。

[關鍵詞]PEG化青霉素；紅細胞溶血；紅細胞脆性；紅細胞膜流動性

0引言

青霉素屬于臨床上的常用藥物，多用于針對嗜血桿菌、革蘭陽性或陰性球菌等多種感染的治療[1-3]。青霉素本身毒性低、活性強、臨床療效穩定且安全[4]，但由于青霉素類藥物的濫用，導致患者出現過敏性休克、溶血反應、器官或組織過敏等不良反應，臨床常采用針對性的藥物治療來對抗過敏反應，但溶血反應病情發作危急，搶救不當可導致死亡，目前尚無很好的解決辦法[5-6]。張桂蘭等[6]報道，青霉素引起自身免疫性溶血死亡1例，黎世堯[7]和曾宏等[8]也報道青霉素致急性溶血1例。PEG為美國FDA批準的藥用級注射輔料，無毒、無免疫原性、無抗原性，可與蛋白質、多肽、氨基酸等活性藥物分子進行化學鍵合，鍵合后PEG可將其許多優越性能賦予被修飾活性藥物分子，很大程度上延長藥物體內作用時間，提高生物利用度，增加藥效，還可減少原型藥物的不良反應[9-10]。前期研究發現，PEG化青霉素的生物利用度提高了2.6倍，藥效幾乎為青霉素的2倍。在前期研究的基礎上，筆者擬采用PEG修飾青霉素降低其溶血不良反應，現報道如下。

1材料與儀器

1.1藥品與試劑注射用青霉素鈉[以下簡稱PEN，國藥準字：H13021633，批號：141108；規格：0.6 g(100萬U)，石藥集團中諾藥業石家莊有限公司]；青霉素鈉原料藥(國藥準字：H14021785，純度：99.2%，批號：141211，國藥集團威奇達藥業有限公司)；mPEG-OH(分子量約4 800 Da，北京凱正生物工程發展有限責任公司)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl，浙江普康化工有限公司)，4-二甲氨基吡啶(DMAP，上海共價化學科技有限公司)，NaCl和乙酰苯肼(以下簡稱APH，國藥集團化學試劑北京有限公司)，生理鹽水(北京雙鶴藥業股份有限公司)。

1.2儀器與設備Varioskan Flash全波長多功能酶標儀(北京平利洋醫療設備有限公司)，BP210S型電子天平(北京Sartorius儀器系統有限公司)，SIGMA3-15臺式離心機(德國SIGMA公司)，LRH-70生化培養箱(北京恒奧生物科技有限公司)。

1.3動物SD大鼠，雄性，250～280 g，由中國醫學科學院實驗動物研究所提供，合格證號:SCXK京2014-0001。

2方法

2.1PEG化青霉素的制備精密稱取480.7 mg mPEG-OH，青霉素鈉原料藥36.2 mg，溶解于2 mL無水二氯甲烷中，然后加入43.7 mg的EDC·HCl(縮合劑)和12 mg的DMAP(催化劑)，攪拌24 h，取出反應產物，減壓濃縮至一定體積，迅速加入定量的無水乙醚，輕微振蕩，冰浴5 h，可見白色絮狀沉淀物，用膠頭滴管吸取上層乙醚并棄去。再以適量的異丙醇，反復多次洗滌沉淀物(PEG-PEN不溶于異丙醇，參與反應物溶解，除雜)，最后將沉淀物于30～40 ℃真空干燥，稱重，即為PEG化青霉素(PEG-PEN)，經HPLC檢測，純度達96%以上，載藥量為7%。

2.2紅細胞懸浮液的制備選用對紅細胞內G6PD活性有干擾作用的強氧化劑乙酰苯肼(APH)為造模藥，復制G6PD缺陷(G6PD酶活性降低)大鼠模型。以1%APH生理鹽水溶液l mL/100 g體重給健康雄性大鼠皮下注射，每天上午1次，連續2次，在體給藥實驗組于造模第2天晚上禁食，12 h后，腹主動脈取血，小心注入含有血液保養液的試管內抗凝保存，用生理鹽水小心洗滌，1 500 r/min離心4 min，重復5~6次，直至上清液清亮，配制成所需濃度(10%、50%)的紅細胞混懸液[11]。

2.3溶血率與時間關系

2.3.1受試液的配制取注射用青霉素鈉1瓶，加入適量生理鹽水稀釋溶解，將溶解后的注射用青霉素鈉轉移至100 mL容量瓶，再加生理鹽水稀釋至100 mL，即得濃度為6‰的青霉素注射劑。精密稱取PEG化青霉素約430 mg(含青霉素30 mg)，用10 mL生理鹽水溶解，使用前臨時配制，即得濃度為6‰ 的PEG化青霉素溶液。

2.3.2紅細胞溶血率的測定移取以上配制好的6‰青霉素注射劑和PEG化青霉素各200 μL至1.5 mL的潔凈EP管中，陰性對照管加200 μL生理鹽水，陽性對照管加200 μL蒸餾水；然后用移液槍吸取10%紅細胞懸液200 μL，添加到各管中，低速渦漩30 s，使紅細胞懸液與受試物混合均勻。各管置于37 ℃生化培養箱中孵育，分別于0.5、1、2、3、4、5、6 h將受試物從生化培養箱中取出，觀察血樣凝集反應(紅細胞聚集成塊，輕微振蕩后能完全分散即假凝集，輕微振蕩后凝集物不能分散則為真凝集)。各管1 500 r/min離心，精密吸取上清液150 μL，轉移到96孔酶標板，用酶標儀于540 nm下測定吸光度(OD)，按以下公式計算溶血百分率，各管平行3復孔[12]。溶血率計算公式(%)=(樣品管OD值-陰性對照管OD值)/(陽性對照管OD值-陰性對照管OD值)×100%。

2.4溶血率與濃度關系

2.4.1系列濃度受試液的配置取以上配制好的6‰青霉素注射劑，依次用生理鹽水倍半稀釋成青霉素濃度為6‰、3‰、1.5‰、0.75‰、0.375‰、0.19‰、0.1‰、0.05‰的系列溶液，同樣的方法可制備系列等濃度的PEG化青霉素溶液。

2.4.2紅細胞溶血率的測定移取以上配制好的青霉素和PEG化青霉素系列溶液各250 μL至1.5 mL的潔凈EP管中，培養箱中孵育時間為3 h，其余同上述紅細胞溶血率的測定方法。

2.5紅細胞滲透脆性試驗

2.5.1NaCl系列溶液的制備將1% NaCl溶液和蒸餾水進行配比，制備成濃度為0.17%～0.82%的系列NaCl溶液，備用。

2.5.2受試藥的配制精密稱取青霉素鈉原料藥12 mg與以上不同濃度的NaCl溶液4 mL混合均勻，即得濃度為3‰的系列青霉素NaCl溶液；精密稱取PEG化青霉素43 mg(含青霉素3 mg)，與以上不同濃度的NaCl溶液1 mL混合均勻，即得濃度為3‰的系列PEG化青霉素NaCl溶液；取以上不同濃度的NaCl溶液1 mL，作為空白對照。

2.5.3紅細胞滲透脆性的測定用移液槍精密吸取50%紅細胞懸液20 μL，加入到已添加藥物的系列NaCl溶液(3‰青霉素或3‰ PEG化青霉素)中，各管置于37 ℃生化培養箱中孵育3 h，其余同上述紅細胞溶血率的測定方法，以生理鹽水管為陰性對照管，蒸餾水管為陽性對照管，則可計算出各管的溶血百分率。最后采用合適的數學模型，建立NaCl濃度與溶血率的關系，計算PEG化青霉素組(PEG-PEN組)、青霉素組(PEN組)和空白組各自的H50%(當紅細胞溶血率為50%時所對應的NaCl濃度)。

2.6紅細胞膜流動性以四氫呋喃作溶劑配制2×10-3mol/L的儲存液，于棕色瓶中4 ℃低溫保存，四氫呋喃工作液臨用前以等滲PBS稀釋。采用PBS配置濃度6‰青霉素和PEG化青霉素溶液，加入適量濃度為50%的紅細胞懸液，再與四氫呋喃工作液等體積混勻，于37 ℃水浴孵育2 h，檢測偏振熒光(激發光波長：362 nm，發射光波長：430 nm)，以空白組為基準，按下列公式計算熒光強度I，熒光偏振度P和微粘度η，比較兩組藥物對紅細胞膜流動性的影響。P=IVV-GIVH/IVV+GIVH;η=2P/(0.46-P)，式中IVV和IVH分別是起偏和檢偏器光軸為垂直和水平方向時測得的熒光強度，G是校正因子。

2.7統計學處理所獲數據采用SPSS 13.0處理，各處理組之間的差異進行樣本t檢驗。

3結果

3.1溶血率與時間關系見圖1。由圖1數據分析可知，PEG化青霉素的紅細胞溶血百分率明顯低于青霉素注射劑，說明PEG修飾技術具有一定的抗紅細胞溶血作用。青霉素注射劑誘導的紅細胞溶血隨時間延長，具有明顯增長趨勢；當時間超過3 h后，其增長趨勢出現了一個拐點，相對比較緩慢。而PEG化青霉素紅細胞溶血率曲線比較平緩，基本維持在5%左右，表明PEG修飾技術可以明顯減少青霉素的紅細胞溶血現象。

圖1　PEG化青霉素和青霉素誘導的溶血與時間的關系

3.2溶血率與濃度關系見圖2。由圖2數據分析可知，在低濃度條件下，青霉素注射劑的溶血率較小，當藥物濃度增大時，尤其當青霉素濃度較高時，青霉素注射劑的溶血率達到25%左右，恰好與文獻報道青霉素注射劑一般在高濃度時出現紅細胞溶血現象相一致[6]。而PEG化青霉素的溶血率僅為3%～6%，幾乎沒有出現明顯的溶血現象，表明PEG修飾技術具有一定的抗紅細胞溶血作用。

圖2　溶血與不同濃度的PEG化青霉素和青霉素的對比研究

3.3紅細胞滲透脆性PEG-PEN組、空白組和PEN組的紅細胞脆性具體數據結果見圖3，由圖3可見，PEG化青霉素的紅細胞溶血率明顯低于青霉素注射劑，說明青霉素經PEG修飾后，對紅細胞膜的刺激作用大量減小。PEG-PEN組對紅細胞脆性的影響小于空白組。PEN組、空白組和PEG-PEN組紅細胞脆性曲線均符合Boltzmann方程，其H50%分別為52.9%、48.0%和43.6%。見表1。

圖3　PEG化青霉素、青霉素和空白溶液紅細胞脆性的對比研究

組別曲線方程H50%空白組y=2.5648+87.34841+e(x-0.4867)/0.0387,r=0.998948.0PEG-PEN組y=2.0703+60.06531+e(x-0.4926)/0.0411,r=0.998443.6PEN組y=11.7759+81.55811+e(x-0.5247)/0.0345,r=0.998952.9

3.4紅細胞膜流動性與空白組比較，PEN組的熒光偏振度明顯增大，微粘度明顯增大，紅細胞膜流動性下降顯著；PEG-PEN組熒光偏振度與PEN組相比顯著減少，基本與空白組數據相近，表明PEG修飾技術具有穩定紅細胞膜、降低流動性的作用。見表2。

表2　各組藥物對紅細胞膜流動性的影響

注：與PEN組比較，*P<0.05，**P<0.01

4討論

青霉素注射劑溶血不良反應主要出現在大劑量用藥患者，且患者多為體質較弱的老年人，可能因為這些特殊人群紅細胞膜較脆弱，溶血的幾率比健康人群大。故本實驗采用對紅細胞內G6PD活性有干擾作用的強氧化劑乙酰苯肼(APH)進行造模，制作G6PD缺陷(G6PD酶活性降低)大鼠模型，模擬臨床上這種紅細胞膜較脆弱的癥狀，便于比較PEG化青霉素與青霉素誘導的紅細胞溶血的差異。

青霉素為半抗原藥物,臨床過敏反應較多,體質較弱的患者出現溶血幾率增大，停用后很快得以改善,可以確定溶血反應由青霉素引起。研究認為，其可能的機制為青霉素進入機體后，分子中的β-內酰胺環打開，與血漿和組織蛋白結構中的氨基共價結合，由半抗原變成藥物性全抗原，其中一種主要的大抗原決定簇誘導產生的抗體IgG在血管中與吸附青霉素的紅細胞相互作用,造成紅細胞溶解而致溶血[7]。PEG為無毒、無免疫原性、生物相容性良好的藥用高分子輔料，已通過美國FDA批準上市銷售。PEG與青霉素結合后，由于大分子長鏈狀結構，可纏繞包裹于青霉素小分子藥物表面，掩蓋該藥物本身的免疫原性，故可以很大程度上減少青霉素誘導紅細胞溶血的幾率。目前，國外已有大量報道采用PEG修飾技術，降低活性藥物的紅細胞溶血[13-15]。Gajbhiye等[16]采用PEG修飾來減少PPI 5.0G樹狀聚合物的紅細胞溶血現象。當PPI 5.0G樹狀聚合物的濃度為0.1%、0.2%、0.3%和0.4%時，紅細胞溶血率分別為9.2%±1.06%、12.2%±2.18%、14.7%±1.02%和16.9%±1.93%；而PPI 5.0G樹狀高聚合物經PEG修飾后，其紅細胞溶血率下降為1.5%±0.35%、2.3%±0.52%、2.9%±0.42%和3.4%±0.33%。Gajbhiye等發現，PPI 5.0G樹狀聚合物經PEG修飾后的溶血率顯著下降，可能原因是PEG大分子具有包裹和屏蔽作用，掩蓋了PPI 5.0G樹狀聚合物的荷電性和離子效應，從而減少其與紅細胞膜的相互作用。從PEG化青霉素和青霉素紅細胞溶血率的對比研究發現，在低劑量情況下，兩者無明顯差別，在高劑量情況下，青霉素出現了明顯的紅細胞溶血現象，而PEG化青霉素的溶血率始終保持在3%～6%。從PEG化青霉素和青霉素紅細胞滲透脆性結果分析，兩者的H50%分別為43.6%和52.9%，PEG-PEN組H50%值小于空白組(48.0%)?？赡艿脑蚴荘EG本身為血溶性良好的藥用高分子輔料，加之其長鏈狀的大分子體系，能纏繞并附著在紅細胞周圍，從而減少紅細胞之間的聚集，類似固化了整個紅細胞體系的空間布局，大大減少了紅細胞之間相互碰撞出現溶血的幾率。紅細胞膜流動性實驗結果表明，PEG化青霉素對紅細胞膜的影響非常輕微，可為PEG修飾技術降低青霉素誘導的紅細胞溶血現象提供一些科學解釋。

綜上所述，PEG化青霉素可以很大程度上降低原型藥物的溶血不良反應，可能與PEG藥用輔料的無毒、無免疫原性及大分子體系的纏繞包裹減少紅細胞之間的碰撞有關。另外，由于PEG化青霉素可以降低免疫原性，使得由于青霉素的抗原性引發的過敏反應，如藥疹、蕁麻疹、哮喘等可能減少，有待于進一步研究。

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Study on reducing hemolysis by PEGylated penicillinRAO Xiu-li (Jiangxi Jiminkexin Group Co.,LTD,Nanchang 102600,China)

[Abstract]ObjectiveTo analyze the effects of PEGylated penicillin (PEG-PEN) on reducing hemolytic via the glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD)-deficient rats’ blood.MethodsThe rat model with G6PD-deficiency was established via sc injecting 1% acetylphenyl-hydrazine. Then the G6PD-deficient erythrocyte suspension obtained from the rat model was used to evaluate the hemolytic effects of PEN and PEG-PEN by detecting the hemolytic activity,erythrocyte osmotic fragility and membrane fluidity of erythrocytes.ResultsIt was found that PEN could cause serious hemolysis to the erythrocyte suspension with the increase of drug concentration and the prolongation of drug incubation time,the hemolytic rate of PEN was up to 25%,while no significant hemolysis was found in PEG-PEN group.Additionally,the result of erythrocyte osmotic fragility indicated that PEG-PEN exerted a slight effect on the erythrocyte membranes,the H50%was much less than that of PEN(43.6% vs.52.9%). Erythrocyte membrane fluidity indicated that the effect of PEG-PEN on erythrocyte membrane fluidity was very slight.ConclusionPEG-PEN plays an important role in reducing the side effect of hemolysis induced by PEN. The low hemolytic activity of PEG-PEN makes it a favorable candidate forinvivotests and PEG-PEN could also provide useful insight for the further formulation development as an innovative drug.

Key words：PEGylated penicillin;Hemolysis;Erythrocyte osmotic fragility;Membrane fluidity of akaryocyte

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201601004

收稿日期：2015-06-29