飼料中不同賴氨酸水平對急性高溫脅迫后刺參非特異性免疫酶活性的影響

劉晨敏， 韓雨哲，任同軍　(大連海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連 116023)

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飼料中不同賴氨酸水平對急性高溫脅迫后刺參非特異性免疫酶活性的影響

劉晨敏， 韓雨哲*，任同軍(大連海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連 116023)

摘要[目的] 研究飼料中不同賴氨酸水平對急性高溫脅迫后刺參非特異性免疫酶活性的影響。[方法] 試驗配制賴氨酸含量分別為0.28%(Ⅰ組)、0.64%(Ⅱ組)、1.19%(Ⅲ組)、1.89%(Ⅳ組)和2.23%(Ⅴ組)的5種刺參試驗飼料，用以投喂體質(zhì)量(1.55 ± 0.01)g的刺參。56 d養(yǎng)殖試驗(養(yǎng)殖期間水溫控制在(18±1) ℃)結(jié)束后，對刺參進(jìn)行急性高溫(28 ℃)刺激，1.5 h后測定其體腔液酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、過氧化氫酶活性(CAT)和總抗氧化能力(T-AOC)。[結(jié)果] 高溫刺激下，隨著賴氨酸添加量的提高，刺參體腔液中的ACP活性呈先升高后下降的趨勢。當(dāng)賴氨酸含量為1.89% 時ACP活性最高，其AKP和T-AOC活性的變化趨勢與ACP基本相同。CAT活性隨著賴氨酸含量的增加而升高，當(dāng)賴氨酸含量為1.19% 時CAT活性達(dá)到最大值，此后呈現(xiàn)下降趨勢。[結(jié)論] 飼料中添加適量的賴氨酸能改善刺參體腔液非特異性免疫酶活性，增強(qiáng)其對急性高溫脅迫的適應(yīng)性并提高其存活率。刺參飼料中賴氨酸的適宜添加范圍為1.19%～1.89%。

關(guān)鍵詞刺參；賴氨酸；急性高溫脅迫；非特異性免疫

刺參因其具有較高的營養(yǎng)和藥用價值，近年來成為我國北方地區(qū)重要的養(yǎng)殖品種之一[1]。刺參屬于變溫性海洋動物，環(huán)境溫度的變化對其生長、發(fā)育和疾病抵抗力有重大影響。自然海域或池塘養(yǎng)殖及刺參商品運輸過程中都有可能遭遇急性溫度變化，溫度的驟然升高會造成機(jī)體自由基代謝的紊亂，使得機(jī)體內(nèi)自由基大量積累，從而損害了機(jī)體細(xì)胞和組織正常的生理和免疫防御能力，進(jìn)而容易感染病原生物或者在攜帶病原生物時容易發(fā)病[2]。目前，關(guān)于高溫對水生動物免疫指標(biāo)的影響研究比較廣泛。宋林生等[2]研究了溫度驟升對中華絨螯蟹一些免疫化學(xué)指標(biāo)的影響。曹學(xué)順等[3]研究了升溫對“水院1號”和大連養(yǎng)殖刺參非特異性免疫的影響。賴氨酸是魚粉替代植物性蛋白源飼料的第一限制性氨基酸或第二限制性氨基酸，是機(jī)體不能合成的必需氨基酸之一，其對維持水生動物的正常生長、發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)的正常機(jī)能和提高免疫力等方面具有重要作用[4]。近年來，有關(guān)賴氨酸方面的研究報道較多，但在高溫脅迫條件下飼料中賴氨酸的不同水平僅現(xiàn)于對畜禽類生物的生長和發(fā)育等少數(shù)領(lǐng)域的報道。陳燕等[5]研究表明在環(huán)境高溫下通過補充合成的必需氨基酸，降低飼料粗蛋白水平能夠顯著降低肉雞的氨氮排泄量，而不影響其生產(chǎn)性能。在31 ℃高溫環(huán)境條件下，飼料中的賴氨酸含量為1.3%時，可以顯著提高豬的日增重和肉料比[6]。目前，關(guān)于飼料中不同賴氨酸水平對溫度驟升脅迫后刺參非特異性免疫酶的影響尚鮮見報道。筆者研究了飼料中賴氨酸水平對急性高溫脅迫后刺參體腔液中酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、總抗氧化能力(T-AOC)和過氧化氫酶(CAT)活力的影響，旨在為賴氨酸在刺參可持續(xù)養(yǎng)殖方面的應(yīng)用提供試驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料試驗用刺參幼參采自大連水益生海洋生物技術(shù)有限公司，從 3 000頭幼參中隨機(jī)選取大小相等、體質(zhì)健壯的刺參540頭(初始體質(zhì)量為(1.55 ± 0.01) g)進(jìn)行試驗；試驗所用的晶體氨基酸均由生工生物工程(上海)股份有限公司生產(chǎn)。

1.2儀器與試劑

1.2.1試劑。酸性磷酸酶測定試劑盒、堿性磷酸酶測定試劑盒、總抗氧化能力測定試劑盒和過氧化氫酶測定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.2.2儀器。超微粉碎機(jī)(SB500克型)，為上海廣泛工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；60℃恒溫嘉風(fēng)干燥箱(DHG-9240A型)，為上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；制粒機(jī)，為常州品正設(shè)備有限公司產(chǎn)品；高壓蒸汽滅菌鍋(MLS-3781L-PC，Panasonic);加熱棒(XL-999)，為祥龍電器有限公司產(chǎn)品。

1.3試驗飼料以馬尾藻、酪蛋白、明膠、晶體氨基酸的混合物為蛋白源，配制成含賴氨酸含量分別為0.28%(Ⅰ組)、0.64%(Ⅱ組)、1.19%(Ⅲ組)、1.89%(Ⅳ組)和2.23%(Ⅴ組)的5種刺參幼參半精制試驗飼料(試驗飼料組成見表1，其營養(yǎng)成分見表2)。其中，必需氨基酸混合物和非必需氨基酸混合物成分分別見表3和4。

試驗飼料中除賴氨酸外的其他氨基酸的組成模式與刺參整體蛋白的氨基酸組成模式一致。配制飼料參考Han等[7]的方法，略有改動。配制飼料前，飼料原料使用超微粉碎機(jī)粉碎至180目(粒徑為80 μm)以上。飼料中的晶體氨基酸按飼料配方比例稱取后均經(jīng)過預(yù)混，并用糊化的羧甲基纖維素鈉包被并置于60 ℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干后粉碎；與酪蛋白、明膠混合后添加到其他干物質(zhì)混合物中，并加入適量的水后混合均勻，為進(jìn)一步提高飼料的水穩(wěn)定性，再次加入80 ℃水浴下糊化的卡拉膠混合均勻，隨后添加魷魚肝油和適量的水充分混勻形成面團(tuán)混合物后用制粒機(jī)擠壓制成顆粒飼料 (顆粒直徑為1.8 mm)，于60 ℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干。為了進(jìn)一步提高飼料的水穩(wěn)定性，將5組烘干的飼料放在高壓蒸汽滅菌鍋中蒸1 min后，陰干裝袋后置于-20 ℃冰箱中備用。

注：酪蛋白、明膠、羧甲基纖維素鈉和卡拉膠均由上海生工生物科技有限公司生產(chǎn)；所有氨基酸均是L-型，由上海生工生物科技有限公司生產(chǎn)；誘食劑：5 g ?；撬岷? g甜菜堿。每千克預(yù)混料含有維生素和微量元素:維生素A 600 mg、維生素C 2 000 mg、維生素D312.5 mg、維生素E 20 000 mg、維生素K34 000mg、維生素B15 000 mg、維生素B210 000 mg、維生素B612 000 mg、維生素B1220.0 mg、煙酸6 000 mg、泛酸鈣6 000 mg、葉酸400 mg、肌醇15 000 mg、生物素50.0 mg、鐵5 000 mg、銅1 000 mg、錳2 500 mg、鋅1 500 mg、硒30.0 mg。

Note: Casein,gelatin,sodium carboxymethylcellulose and К-carrageenan were all produced by Shanghai Sagon Biotech Co.,Ltd.All the amino acids were L-type and produced by Shanghai Sagon Biotech Co.,Ltd.Attractants：5 g taurine and 5 g betaine.Premix per kilogram included the following vitamins and microelements：600 mg vitamin A,2 000 mg vitamin C,12.5 mg vitamin D3,20 000 mg vitamin E,4 000 mg vitamin K3,5 000 mg vitamin B1,10 000 mg vitamin B2,12 000 mg vitamin B6,20.0 mg vitamin B12,6 000 mg niacin,6 000 mg pantothenic acid - Ca,400 mg folic acid,15 000 mg inositol,50.0 mg biotin,5 000 mg Fe,1 000 mg Cu,2 500 mg Mn,1 500 mg Zn,and 30.0 mg Se.

1.4飼養(yǎng)管理試驗刺參送至實驗室后先置于2個500 L水槽中暫養(yǎng)馴化7 d。試驗共設(shè)置 5個處理組，每組3個平行，共15個水族箱，每箱30頭刺參。試驗養(yǎng)殖系統(tǒng)為循環(huán)水系統(tǒng)(每箱進(jìn)水速率為9 L/h)，試驗用水族箱為容積35 L的長方形玻璃纖維水缸，水源為經(jīng)沙濾和海綿、活性炭過濾后的海水。一個200 L的水槽用于盛裝沙濾海水，并使用加熱棒加熱，使水溫保持在(18 ± 1) ℃，作為更換水的水源。整個養(yǎng)殖試驗期間，每天清理糞便和收集殘餌，并換水1次，換水量為1/4，主要補充蒸發(fā)及收集殘餌、糞便時損失的水分，每天16:30投喂1次(起始投餌量5%)，根據(jù)情況適當(dāng)調(diào)整飼喂量，達(dá)到飽食投喂。養(yǎng)殖期間，水溫保持在(18±1) ℃，鹽度保持在(30±1)‰，pH保持在(7.7 ± 0.2)，全天連續(xù)充氧，全天進(jìn)行避光處理。

1.5急性高溫處理方法取一個50 L水槽加入適量的海水，使用加熱棒加熱并使海水維持在28 ℃，將5個貼有標(biāo)簽的1 000 mL的燒杯依次加入溫度28 ℃的養(yǎng)殖海水800 mL，每個燒杯保持連續(xù)充氧。56 d養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，從每個水族箱中隨機(jī)選取3頭刺參，并將各處理組3個平行的刺參合并置于在對應(yīng)編號的燒杯中1.5 h。

1.6樣品收集及指標(biāo)測定

1.6.1樣品收集。高溫處理試驗結(jié)束后，每個處理組的刺參全部取出并進(jìn)行免疫酶活性的測定。將取出的刺參置于冰盤上進(jìn)行體腔液的采集，于4 ℃、3 000 × g低溫冷凍離心機(jī)中離心20 min， 取上清液分裝于 2.0 mL的離心管中，置于-80 ℃冰箱中備用，用于體腔液免疫酶的測定。

注：色氨酸在水解過程中遭到破壞，未被檢出。

Note：Tryptophan was destroyed during hydrolytic process,so that it was not detected.

1.6.2指標(biāo)測定。ACP、AKP、T-AOC 及CAT活性均使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測定。ACP和AKP活性單位的定義為： 每克樣品蛋白在37 ℃與基質(zhì)反應(yīng)30 min產(chǎn)生1 mg酚，為1個酶活性單位；T-AOC活性單位的定義為：在37 ℃時，每分鐘每毫升血清(漿)使反應(yīng)體系的吸光度(OD)值每增加0.01時，為1個總抗氧化能力單位。CAT活性單位的定義為： 每毫升血清或血漿每秒鐘分解1 μmol的過氧化氫的量為1個活力單位。

1.7數(shù)據(jù)處理試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，使用SPSS 13.0軟件包(Chicago,IL,USA)對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計與分析，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行組間顯著性檢驗。若差異顯著(P<0.05)，采用 Duncan’s法進(jìn)行多重比較分析。

2結(jié)果與分析

2.1酸性磷酸酶活性從圖1可以看出，急性高溫處理后，隨著餌料中賴氨酸含量的增加，刺參體腔液中ACP活性呈先升高后下降的趨勢，Ⅳ組ACP活性達(dá)到最大值，并顯著高于Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ組(P<0.05)，但與Ⅲ組無顯著差異(P>0.05)。

2.2堿性磷酸酶活性從圖2可以看出，急性高溫處理后刺參體腔液中AKP活性隨著餌料中賴氨酸含量的增加呈先升高后下降的趨勢。Ⅳ組AKP活性最高，Ⅲ組次之，但Ⅲ組和Ⅳ組均顯著高于Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ組(P<0.05)。

2.3總抗氧化能力從圖3可以看出，急性高溫處理后，刺參體腔液中T-AOC活性隨餌料中賴氨酸含量的增加呈先升高后下降的趨勢。Ⅳ組刺參的T-AOC活性最高，并顯著高于Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ組(P<0.05)，但與Ⅲ組無顯著差異(P>0.05)。

2.4過氧化氫酶活性從圖4可以看出，急性高溫處理后，Ⅲ組刺參體腔液中CAT活性顯著高于Ⅰ和Ⅱ組(P< 0.05)，但與Ⅳ和Ⅴ組無顯著差異(P>0.05)。

3討論與結(jié)論

水溫作為最重要的生態(tài)因子之一，對刺參生長和生理狀態(tài)起到非常重要的作用[8]。刺參的最適生長溫度為15～18 ℃[9]，若超過適宜溫度會導(dǎo)致刺參體內(nèi)代謝紊亂，免疫功能降低，從而誘發(fā)疾病。刺參是一種低等的營底棲碎屑食性生物[10]并且特異性免疫機(jī)制不完善，主要依靠非特異性免疫來提高對疾病的抵抗力，其體腔液AKP、ACP、T-AOC及CAT活性是反映機(jī)體免疫能力的重要非特異性免疫酶，在機(jī)體防御反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[11]。

刺參免疫反應(yīng)主要包括細(xì)胞免疫和體液免疫，二者緊密聯(lián)系，吞噬作用是機(jī)體內(nèi)部防御的第一道防線，在機(jī)體的所有免疫應(yīng)答中居于重要地位[12]。吞噬完成后，吞噬細(xì)胞主要通過ACP和AKP來降解外源物質(zhì)[13]。ACP和AKP是軟體動物溶酶體酶的重要組成部分，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用[14]，二者在甲殼動物的防御機(jī)制中直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝，可以加速物質(zhì)的攝取和轉(zhuǎn)運，形成水解酶體系，破壞和消除侵入體內(nèi)的異物，達(dá)到機(jī)體防御的功能[15-16]。方美娟等[17]研究發(fā)現(xiàn)低溫和高溫都會使Hemibarbusmaculates的ACP和AKP活性顯著降低，導(dǎo)致免疫力下降，出現(xiàn)死亡。趙春蓉[18]研究表明飼料添加適量的穩(wěn)定化的賴氨酸能夠顯著提高幼建鯉的AKP活性，增強(qiáng)其免疫功能。鄢華[19]研究表明飼喂賴氨酸缺乏飼料，能顯著降低幼建鯉的ACP活性和疾病抵抗能力。該研究結(jié)果表明在急性高溫脅迫下刺參體腔液中的ACP和AKP活性隨飼料中賴氨酸含量的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。推測這種現(xiàn)象的原因可能是急性高溫脅迫導(dǎo)致刺參體內(nèi)的代謝發(fā)生紊亂，而刺參體內(nèi)的吞噬作用被攝入的賴氨酸所激發(fā)，進(jìn)而使ACP和AKP的活性發(fā)生變化，以提高其免疫功能。飼喂添加1.89% 賴氨酸飼料的處理組刺參ACP和AKP酶活性最高。由此可見，當(dāng)飼料中賴氨酸的添加水平為1.89% 時，能顯著提高刺參的ACP和AKP活性。

T-AOC是生物體對外來刺激的應(yīng)激能力，是衡量機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能狀態(tài)的綜合性指標(biāo)[20]。T-AOC水平的高低反映機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶促體系對外界刺激的應(yīng)激能力[21]。CAT是抗氧化體系中重要的一種酶，也是生物體內(nèi)過氧化物酶體的標(biāo)志酶[22]，它與過氧化氫結(jié)合，分解細(xì)胞代謝產(chǎn)生的過氧化氫為水和氧氣，從而清除過氧化氫，防止羥基自由基的形成[23]。宋林生等[2]研究發(fā)現(xiàn)溫度驟升會嚴(yán)重影響中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)機(jī)體的免疫防御能力，使機(jī)體抗氧化酶活力發(fā)生顯著變化，導(dǎo)致自由基代謝異常。張婷[24]研究表明飼糧中添加1.17%的賴氨酸可以顯著增強(qiáng)籠養(yǎng)蛋雛鴨的血清T-AOC及血清和肝臟總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性。在該研究的急性高溫脅迫試驗中，刺參體腔液中的T-AOC和CAT水平均隨著飼料賴氨酸水平的升高呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，當(dāng)飼料賴氨酸水平為1.89% 時T-AOC高于其他處理組，當(dāng)賴氨酸水平為1.19% 時CAT活性達(dá)到最大值，但與Ⅳ(飼料賴氨酸含量為1.89%)組無顯著差異。造成這一趨勢的原因可能是急性高溫脅迫導(dǎo)致機(jī)體活性氧自由基代謝的紊亂而瞬間增多，當(dāng)飼料中賴氨酸的添加量為1.89% 時顯著提高了刺參體內(nèi)的CAT活性及細(xì)胞中其他大量酶或非酶物質(zhì)來提高抗氧化防御機(jī)制，從而清除多余的活性氧自由基，但隨著高溫脅迫時

間的延長和飼料中賴氨酸含量的增加，抗氧化體系中的各種酶類活性因消耗或因被抑制而降低，從而導(dǎo)致CAT活性和T-AOC水平下降。

筆者展開的為期56 d的養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，對養(yǎng)殖刺參的生長指標(biāo)(主要包括終末體重、體增重、特殊增長率及存活率)進(jìn)行了測定。結(jié)果表明飼喂不同賴氨酸水平飼料的刺參的終末體重、體增重、特殊增長率及存活率的最大值基本均出現(xiàn)在賴氨酸含量為1.19%的Ⅲ組。從免疫角度來看，含1.19%賴氨酸的Ⅲ組刺參體腔液中的ACP、AKP、T-AOC和CAT活性與賴氨酸含量為1.89%的Ⅳ組無顯著差異，并且CAT活性在賴氨酸含量為1.19%的Ⅲ組取得最大值。綜合考慮生長指標(biāo)和免疫酶活性，刺參飼料中賴氨酸的最適添加范圍為1.19%～1.89%。

該試驗結(jié)果表明飼料中添加適量的賴氨酸能夠顯著改善刺參體腔液非特異性免疫酶活力，增強(qiáng)其對急性高溫脅迫的抵抗力并提高其存活率，刺參飼料中賴氨酸的適宜添加范圍為1.19%～1.89%。

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Effects of Dietary Lysine Level on Non-specific Immune Enzyme Activities ofApostichopusjaponicusafter Acute Heat Stress

LIU Chen-min,HAN Yu-zhe*,REN Tong-jun

(Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North China’s Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian,Liaoning 116023)

Key wordsApostichopusjaponicus; Lysine; Acute heat stress; Non-specific immune

Abstract[Objective] To research the effects of dietary lysine level on non-specific immune enzyme activities ofApostichopusjaponicusafter acute heat stress.[Method] Lysine contents were designed to be five groups of 0.28% (group Ⅰ)，0.64% (group Ⅱ)，1.19% (group Ⅲ)，1.89% (group Ⅳ) and 2.23% (group Ⅴ),which were used to feedA.japonicuswith the body weight being (1.55 ± 0.01) g.After the end of feeding trial for 56 d(water temperature maintained at 18 ± 1 ℃),acute heat temperature (28 ℃) stimulation ofA.japonicuswas carried out.Acidic phosphatase (ACP),alkaline phosphatase (AKP),catalase activity (CAT) and total antioxidant capacity (T-AOC) of coelomic fluid were detected at 1.5 h.[Result] Under the stress of high temperature,ACP activity in coelomic fluid ofA.japonicusfirstly enhanced and then declined as the adding amount of lysine increased.When lysine content was 1.89%,ACP activity was the maximum.AKP and T-AOC activities had basically the same change trend with ACP.CAT activity enhanced as the lysine content increased,and reached the maximum value when lysine content was 1.19%,and then showed a downward tendency.[Conclusion] Adding proper amount of lysine in feedstuff improves the nonspecific immune enzyme activity in coelomic fluid ofA.japonicus, and enhances the survival rate and adaptability under acute heat stress.The suitable adding range of lysine inA.japonicusfeedstuff is 1.19%-1.89%.

基金項目國家海洋公益項目(201405003)；大連市科技興海項目(20140101)。

作者簡介劉晨敏(1988- )，女，河南商丘人，碩士研究生，研究方向：生理學(xué)。*通訊作者，講師，博士，碩士生導(dǎo)師，從事水產(chǎn)動物營養(yǎng)學(xué)和水族科學(xué)方面的研究。

收稿日期2016-01-26

中圖分類號S 963

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)07-092-04