尼羅羅非魚cyp17a2生物信息學和雌雄性腺表達差異分析

王偉偉　(山西農業大學動物科技學院，山西太谷 030801)

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尼羅羅非魚cyp17a2生物信息學和雌雄性腺表達差異分析

王偉偉(山西農業大學動物科技學院，山西太谷 030801)

摘要[目的]進一步研究尼羅羅非魚cyp17a2的編碼蛋白的P450c17-Ⅱ的生物學特征以及在性腺中的表達特點。[方法]根據NCBI網站上登錄的尼羅羅非魚的cyp17a2基因全編碼序列，利用相關的生物信息學分析軟件分析cyp17a2基因編碼的P450c17-Ⅱ的理化性質和結構特點，并分析該基因在不同性腺中的表達。[結果]羅非魚cyp17a2基因編碼的多肽含有521個氨基酸，pI為8.09，脂溶指數為98.33，是不穩定蛋白。羅非魚cyp17a2基因的二級結構以不規則卷曲所占比例最大，為58.16%，α-螺旋占22.07%。P450c17-Ⅱ是二次跨膜蛋白，有眾多蛋白質翻譯后修飾位點。在60日齡性腺中，cyp17a2在精巢中的表達量顯著高于卵巢。[結論]cyp17a2在尼羅羅非魚不同性腺中的差異表達和編碼P450c17-Ⅱ的生物信息學分析為研究cyp17a2在繁殖過程中的作用奠定了基礎。

關鍵詞尼羅羅非魚；cyp17a2；性腺；生物信息學

性類固醇激素在大多數脊椎動物的繁殖中發揮著重要作用，細胞色素P450c17是類固醇激素生物合成通路的重要酶，具有17，20-裂解酶活性和17a-羥基化酶活性[1]。

在哺乳動物和低等脊椎動物中只發現1種P450c17，而在一些硬骨魚類中發現了2種不同基因編碼的細胞色素P450c17s，為P450c17-I 和P450c17-Ⅱ[2]，它們分別由cyp17和cyp17a2所編碼。P450c17-I具有17，20裂解酶和17a-羥化酶活性，而P450c17-Ⅱ僅具有17a-羥化酶活性。很多魚類的cyp17 基因已經得到克隆，而cyp17a2基因只在部分魚類中得到克隆[3]。

對于新發現的編碼魚類特有的cyp17a2的表達做過相關的研究，在牙鲆的成年魚中cyp17a2的表達量在頭腎組織中最高，其在卵巢、精巢和腦中的表達量次之，而在其他組織中未檢測到[4]。在半滑舌鰨中，cyp17a2基因在卵巢中的時間表達與性腺發育呈正相關，而在精巢中的時間表達與性腺發育呈負相關[5]。

尼羅羅非魚是世界性的養殖魚類，cyp17a2基因已經被克隆[6]，并發現其在頭腎和性腺表達。在8月齡羅非魚精巢的間質細胞上有表達，在卵巢中僅在前卵黃期卵母細胞的膜細胞上有表達。在卵母細胞成熟周期中，cyp17a2對卵母細胞的成熟是必需的，其表達模式與芳香化酶一致。

作為甾體激素合成通路中重要的酶，利用生物信息學的方法全面分析羅非魚cyp17a2基因編碼的蛋白結構和功能，有助于獲取該基因更多的信息。2月齡的羅非魚雌雄幼魚分別處于精子發生和卵黃積累的關鍵時期。筆者根據NCBI網站上登錄的尼羅羅非魚的cyp17a2基因全編碼序列，利用相關的生物信息學分析軟件分析cyp17a2基因編碼的P450c17-Ⅱ的理化性質和結構特點，并對該階段雌雄性腺中cyp17a2的表達進行分析，旨在為進一步研究cyp17a2在魚類繁殖過程中的作用奠定基礎。

1材料與方法

1.1羅非魚cyp17a2基因編碼的蛋白的生物信息學分析

1.1.1羅非魚cyp17a2序列的獲取。從NCBI網站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上下載羅非魚cyp17a2基因的CDS區序列(NM_001279458)和氨基酸序列。

1.1.2序列的生物學信息分析。利用表1中的軟件和在線工具，分析cyp17a2編碼蛋白的理化性質、信號肽、跨膜區、二級結構等。

1.2cyp17a2基因在尼羅羅非魚幼魚雌雄性腺中的表達差異

1.2.1試驗動物和試劑。試驗采用60日齡的雌雄尼羅羅非魚幼魚各6尾，經麻醉后解剖取出性腺組織，置于液氮中進行速凍，然后轉移至-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于后續mRNA的提取。RNA提取試劑盒和逆轉錄熒光定量試劑盒，均購自大連TaKaRa公司。

1.2.2方法。

1.2.2.1mRNA的提取及cDNA第一鏈的合成。按照mRNA提取試劑盒說明書提取mRNA，測定mRNA的OD值后，取500 ng mRNA根據說明書(TaKaRa，Japan，DRR036A)要求合成cDNA第一鏈。

1.2.2.2引物的設計和熒光定量。根據NCBI網站上登錄的羅非魚cyp17a2基因CDS全長序列(NM_001279458)和18S rRNA序列(JF698683.1)，利用NCBI網站上的Primer blast(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast/)在線軟件來設計引物，引物序列如表2所示。根據熒光定量試劑盒說明書配制反應液，使用ABI 7500 熒光定量PCR儀中進行擴增，擴增程序為：預變性95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s，45個循環。

2結果與分析

2.1羅非魚cyp17a2基因編碼蛋白生物信息學分析

2.1.1羅非魚cyp17a2編碼的蛋白的基本理化性質。羅非魚cyp17a2 CDS區有1 563 bp堿基對，編碼521個氨基酸。通過ProtParam程序對羅非魚cyp17a2氨基酸序列進行基本理化性質預測，羅非魚cyp17a2編碼氨基酸的等電點(pI)為8.09，說明該基因編碼的蛋白質為堿性蛋白。羅非魚cyp17a2的脂溶指數為98.33，說明羅非魚cyp17a2是一種脂溶蛋白。羅非魚cyp17a2的總平均親水性為-0.048，為親水性蛋白。羅非魚cyp17a2的不穩定系數小于40，是一種穩定蛋白質。

2.1.2羅非魚cyp17a2蛋白的跨膜區結構預測以及酶重要的功能區。HMMTOP 顯示該蛋白有2個跨膜區，位于17～34和55～74，N-端位于外側，TMHMM-2.0軟件也顯示該蛋白有2個跨膜區(圖1)，說明該蛋白處于細胞膜上。在cyp17a2編碼的氨基酸序列中發現P450c17保守的特有區域、Ozols tridecapeptide 區域(參與類固醇底物結合)和細胞色素P450 cysteine heme-iron 信號區域(圖2)。

2.1.3羅非魚cyp17a2蛋白信號肽預測。使用SignalP 4.0軟件，預測cyp17a2蛋白質的信號肽，輸出S、C、Y3個值，其最大C分值為0.189(紅線表)，最大S分值(綠線)為0.725，最大Y分值(藍線)為0.320(圖3)，說明該蛋白沒有信號肽。

2.1.4羅非魚cyp17a2蛋白O-糖基化位點預測。對氨基酸序列進行對比分析，羅非魚cyp17a2氨基酸序列中第43、291、292、298、299、364、445、448位點潛力值都大于0.5的閾值，是潛在的O-糖基化位點，表明羅非魚cyp17a2的氨基酸序列中存在8個O-糖基化位點。

2.1.5羅非魚cyp17a2蛋白N-糖基化位點預測。從圖4可以看出，位于246位點的天冬酰胺(Asn)的N-糖基化潛力值為0.550 9，大于閾值(0.5)，則這個天冬酰胺為N-糖基化位點。

2.1.6羅非魚cyp17a2蛋白磷酸化位點預測。從圖5可以看出，羅非魚crp17a2的氨基酸序列中有18個絲氨酸(Ser)和3個蘇氨酸(Thr)的磷酸化潛力值均大于閾值(0.5)，表明羅非魚cyp17a2存在21個磷酸化位點。

2.1.7羅非魚cyp17a2蛋白二級結構預測。從圖6可以看出，羅非魚cyp17a2基因編碼的521個氨基酸所組成的蛋白質中α-螺旋占22.07%，包括115個氨基酸；延伸鏈占19.77%，由103個氨基酸組成；不規則卷曲所占比例最大，為58.16%，包括303個氨基酸。

2.2cyp17a2基因在尼羅羅非魚幼魚雌雄性腺中的表達差異以18SrRNA為內參基因，通過Real-time PCR對尼羅羅非魚的雌雄性腺cyp17a2 基因表達量進行了分析，方差分析表明，該基因在雌雄性腺中表達量差異極顯著(P<0.01)，雄魚顯著高于雌魚(P<0.05)(圖7)。

3結論與討論

該研究中以尼羅羅非魚的cyp17a2編碼的氨基酸序列為研究對象，對其功能進行分析。cyp17a2編碼蛋白為脂溶性蛋白，也是堿性蛋白，比較穩定。疏水作用是蛋白質折疊的重要驅動力，是分析蛋白質跨膜區的重要一步。該蛋白雖有跨膜區，只有1個二次跨膜區域，在整個序列中占的比例很小，因此仍表現出親水性。該蛋白有多個糖基化位點增加了蛋白質的穩定性。在cyp17a2編碼的氨基酸序列中發現了P450c17保守的特有區域、Ozols 十三肽區(參與類固醇底物結合)和細胞色素P450 cysteine heme-iron 信號區域，這些區域與羅非魚cyp17以及其他脊椎動物的cyp17編碼的氨基酸序列高度保守[15]。人類的Arg358(精氨酸)對P450c17的裂解酶活性是必須的[16]，在硬骨魚類P450c17-Ⅰ和其他脊椎動物P450c17的Arg358位于Ozols tridecapeptide region里，而在條斑星鰈[2]和羅非魚的P450c17-Ⅱ的該位置不是Arg，而是Asn代替，這可能解釋P450c17-Ⅱ只有羥化酶活性，而沒有裂解酶活性的原因。

在牙鲆[4]、半滑舌鰨[5]和條斑星鰈[2]中，cyp17a2在多種魚類的性腺中有表達，在半滑舌鰨卵巢中，cyp17a2的時間表達模式與發育呈正相關，而在精巢內表達與性腺發育呈負相關，顯示不同的表達模式。在半滑舌鰨處于Ⅳ期的雌雄性腺中，精巢cyp17a2的表達量遠遠高于卵巢。

該試驗中在60日齡的尼羅羅非魚的幼魚雌雄性腺中均檢測到cyp17a2的表達。此時，尼羅羅非魚性腺正分別處于卵黃積累和精子發生的關鍵時期，P450c17-Ⅱ的羥化酶活性在這2件重要生理事件中的作用很重要。在P450c17-Ⅱ的羥化酶活性作用下孕酮轉化為17α-羥孕酮，然后在不同酶的作用下分別生成雌二醇(E2)和17α，20β-DHP，它們在卵巢分別對卵母細胞生長和卵母細胞最終成熟是必不可少的；在精巢孕激素能啟動精子發生、誘導精子成熟和排精，也是間質細胞內雄激素合成的關鍵酶。因為P450c17-Ⅱ缺乏裂解酶活性，在羅非魚性別分化的起始階段(5日齡)不表達，在8日齡在雌魚起始表達來啟動17α，20β-DHP的合成，12日齡在顆粒細胞達到高峰[6]。在日本鰻鱺[17]，17α，20β-DHP對其精子發生減數分裂起始很關鍵。在羅非魚中cyp17a2的起始表達與減數分裂一致。60日齡羅非魚卵巢減數分裂已經完成，處于卵黃積累的階段，而此時精巢處于精子發生減數分裂的前期，高表達的cyp17a2對17α，20β-DHP產生具有促進作用，從而起始減數分裂，因而在精巢高表達。在斑馬魚中也發現cyp17a2的表達與卵巢發育負相關，而與精巢發育正相關。該研究結果有助于進一步分析cyp17a2基因編碼蛋白的結構以及在魚類繁殖活動中的作用。

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Bioinformatics Analysis ofcyp17a2 in Nile Tilapia and Differences of Expression in Gonads

WANG Wei-wei

(College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu, Shanxi 030801)

Key wordsNile tilapia;cyp17a2; Gonads; Bioinformatics

Abstract[Objective] In order to study the biological characteristics of tilapia P450c17-Ⅱ coded bycyp17a2, and expression characteristics in gonads. [Method] The physicochemical properties and construction features were analyzed using biology softwares, according to coding sequence of tilapiacyp17a2 from NCBI, andcyp17a2 expression in different gonads were analyzed. [Result] The complete coding region of tialapia encoded 521 amino acid residues. The theoreticalpIand aliphatic index was 8.09 and 98.33, respectively. P450c17-Ⅱ was basic, fat-soluble and unstable protein. Random coil was most popular in the secondary structure, and was 58.16%, alpha helix accounted for 22.07%. P450c17-Ⅱ was transmembrane, and there were a lot of post-translation modified sites in P450c17-Ⅱ. The expression ofcyp17a2 was higher in testis than in ovary in 60d tilapia. [Conclusion] The differentiation expression ofcyp17a2 in different gonads of Nile tilapia and P450c17-Ⅱ bioinformatics analysis can lay a foundation for researching the role ofcyp17a2 in propagation process.

基金項目山西農業大學創新基金項目(2010025)。

作者簡介王偉偉(1979- )，女，山西晉城人，講師，碩士， 從事水產動物遺傳與育種研究。

收稿日期2016-02-26

中圖分類號S 937.3

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)07-103-04