高效液相色譜法測定大蒜中大蒜素的含量

韓貴芝， 王文軍， 王 芳　 (濟寧醫學院公共衛生學院，山東濟寧 272013)

?

高效液相色譜法測定大蒜中大蒜素的含量

韓貴芝， 王文軍， 王 芳 (濟寧醫學院公共衛生學院，山東濟寧 272013)

摘要[目的]通過有機萃取法中萃取劑的選擇、用量和萃取時間等條件的優化處理，建立大蒜中大蒜素含量測定的分析方法。[方法]將新鮮大蒜搗碎、酶解后，分別用乙醇和乙酸乙酯作為萃取劑萃取得到大蒜素溶液。用高效液相色譜儀分析樣品中大蒜素的含量,確定最佳萃取劑；通過對不同時間段提取物檢測對比，確定最佳萃取時間。[結果]以乙醇作為萃取劑提取大蒜素，大蒜素的平均濃度可以達到28.85 μg/mL，乙酸乙酯提取組中的大蒜素平均濃度為13.24 μg/mL；經對比分析，乙醇提取大蒜素的最佳萃取時間為3.0 h。[結論]乙醇作為實驗室常用的化學試劑具有低毒、無污染、高效的提取效果，可為醫藥、食品等實驗室對大蒜素的提取開發和利用提供參考。

關鍵詞乙醇；乙酸乙酯；大蒜素；萃取時間優化

大蒜為百合科蔥屬植物，在我國有2 000多年的種植歷史。大蒜屬藥食同源植物，其鱗莖中富含鈣、鐵、鋅、鍺等元素以及多種必需氨基酸[1-5]，具有較高的食用和藥用價值，能有效防治高血壓等疾病。在傳統醫學中，大蒜也是一味中草藥，能夠激發免疫功能，誘生出干擾素，抑制生成腫瘤壞死因子，降低致癌物的作用，具有提高人體免疫功能的重要作用[6]。大蒜中的有機含硫化合物——大蒜素，其化學名稱是二烯丙基三硫化物(DATS)。新鮮完整的大蒜中并不含大蒜素，只含有其前體物質——蒜氨酸。蒜氨酸存于大蒜的細胞質中，但當大蒜的細胞破碎后，液泡內的內源蒜酶被釋放并與蒜氨酸接觸，經酶解生成大蒜素。現代醫學研究得出，大蒜素的藥理作用包含以下幾種：抗微生物、抗腫瘤、抗寄生蟲、抗潰瘍、抗衰老、降血壓、降血脂、提高機體免疫力等[7-8]。大蒜素使用安全，不良反應少，具有廣闊的應用前景。因此，大蒜素的開發和研究越來越受到人們的重視。

目前，對大蒜素的提取和測定已有一定的研究，其中有機溶劑提取法、水蒸氣蒸餾法和超臨界CO2萃取法是最常用的提取大蒜素的3種方法[9-11]。水蒸氣蒸餾法具有成本低、設備簡單等優點，但因操作過程中溫度相對較高容易降低蒜酶的活性，降低大蒜素產率。超臨界CO2萃取法因具有工藝簡單、高效節能等優點而在化工、食品和醫藥等領域廣泛應用，但該法所用設備投資較大，不適于實驗室提取。筆者采用有機溶劑萃取法萃取大蒜中的大蒜素，并采用高效液相色譜法(HPLC)進行檢測，比較其萃取效果，并優化萃取時間 ，以期能夠提高大蒜素的產率。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料及試劑。市售普通大蒜；大蒜素標準品，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；乙醇(分析純)；乙酸乙酯(分析純)；甲醇(高效液相色譜專用)。

1.1.2主要儀器。500 mL燒杯、100 mL容量瓶、漏斗、錐形瓶、JJ-2(2003-61)型組織搗碎勻漿機，常州國華電器有限公司；HH·S21·6型雙列六孔電熱恒溫水浴鍋，山東醫療器械廠；TD5M-WS多管架自動平衡離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；RE-48轉蒸發儀器，上海亞榮生化儀器廠；LC210型高效液相色譜儀，上海儀電分析儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1色譜條件。該試驗參照張民等用HPLC法測定大蒜中大蒜素含量所用色譜條件[12]。色譜柱：C18柱，流動相為甲醇∶水為85∶15(V/V)，柱溫30 ℃，流速為0.8 mL/min，檢測波長為214 nm，每次進樣20 μL。

1.2.2大蒜素樣品的制備。將新鮮大蒜去皮，用組織搗碎機搗碎成蒜泥，取3份樣品,每份20 g,分別用保鮮膜密封，利用大蒜細胞破碎后釋放的內源蒜酶常溫酶解30 min，按照料液比1∶4 g/mL向樣品中分別加入等量乙醇。用保鮮膜密封置于40 ℃恒溫水浴鍋中浸提1 h后，將樣品轉移至離心管以1 000 r/min低速離心沉淀，取上清液，使用旋轉蒸發儀進行蒸餾，溫度設定為78 ℃，轉速70 r/min,待體積減至原來的1/4時停止蒸餾，過濾即得濃縮大蒜素液。使用乙酸乙酯作為萃取劑提取大蒜素的步驟與乙醇相同。

1.2.3標準曲線的繪制及樣品測定。以流動相作為溶劑將大蒜素純品制備成200 μg/mL的大蒜素標準儲備液，再用流動相稀釋為100.00、50.00、25.00、12.50 μg/mL的系列溶液，經微孔濾膜過濾后分別精密進樣20 μL，使用高效液相色譜儀對標準系列中大蒜素含量進行測定，以大蒜素濃度(C)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標做標準曲線，得回歸方程。分別準確量取1 mL濃縮大蒜素液，用流動相定容至10 mL，微孔濾膜過濾后分別進樣20 μL進行檢測，根據對待測物質所得峰面積計算得出樣品中大蒜素的含量。

1.2.4萃取時間優化。分別取40 g搗碎大蒜置于5個燒杯中，編號A、B、C、D、E，經酶解、勻漿后，按照料液比1∶4 g/mL加入提取效果較好的溶劑分別置于40 ℃水浴鍋中萃取1、2、3、4、5 h，經旋轉蒸發儀蒸餾、過濾制得大蒜素濃縮液。用微孔濾膜分別對樣品進行過濾，按照前述色譜條件對5份樣品中大蒜素的含量進行測定、比較，確定最佳萃取時間。

1.2.5回收率試驗。精確量取已知大蒜素含量的樣品，向其中加入不同濃度的大蒜素標準品，按照前述色譜條件測定大蒜素的加標回收率。

2結果與分析

2.1大蒜素樣品的高效液相色譜圖圖1為乙醇提取組中大蒜素含量的色譜圖，大蒜素的保留時間為6.084 min，圖2為乙酸乙酯提取組中大蒜素含量的色譜圖。

2.2大蒜素的標準曲線取“1.2.3”中所配制的大蒜素標準系列溶液分別進樣，記錄峰面積，以大蒜素濃度(C)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標作標準曲線，得回歸方程：A=15 950C+74 949，r=0.999 050。

2.3乙醇和乙酸乙酯的提取效果比較由表1可知，乙醇較乙酸乙酯對大蒜素的提取率高，且乙醇對人體相對無毒副作用，故選擇使用乙醇提取大蒜中的大蒜素。

2.4萃取時間的優化選取乙醇作為萃取劑，按照“1.2.4”的方法對大蒜素的萃取時間進行優化。由圖3可知，當萃取時間為3.0 h時，所得提取物中大蒜素的濃度最高，故乙醇提取大蒜素的最佳時間為3.0 h。

2.5回收率測定精確量取1 mL濃度為31.79 μg/mL的樣品溶液，再分別加入1 mL不同濃度的大蒜素標準品，按前述色譜條件對混合液中的大蒜素進行測定，計算回收率。由表2可見，大蒜素的加標回收率在84.4%～88.2%，平均回收率86.4%,而測定結果在80%～120%即可視為優化方法可行。因此，該試驗采用的方法可行。

3結論與討論

大蒜素為無色油狀液體，難溶于水，但易溶于有機溶劑如乙醇、乙酸乙酯、乙醚等中。該研究采用乙醇作為萃取劑提取大蒜素的工藝,得出最佳工藝條件為:大蒜細胞破碎后常溫酶解30 min，加入乙醇，置于40 ℃恒溫水浴鍋中浸提1 h后，使用旋轉蒸發儀78 ℃蒸餾，得濃縮大蒜素液，用HPLC法對樣品中大蒜素含量進行測定，當萃取時間為3.0 h時，所得提取物中大蒜素的濃度最高。

在實驗室中提取大蒜素主要用于食品工業的研究，應選用無毒或低毒的萃取劑，故選乙醇作為萃取劑，且提取結束后，所得大蒜素產品中無不良氣味，優化了大蒜素的提取方法。該方法萃取率高，加標回收率高，線性關系好，可為醫藥、食品等實驗室對大蒜素的提取開發和利用提供參考依據。

參考文獻

[1] 宋衛國,李寶聚,劉開啟.大蒜化學成分及其抗菌活性機理研究進展[J].園藝學報,2004,31(2):263-268.

[2] 鄭永軍.基于分子印跡技術的大蒜功能成分的分離提取及藥理活性研究[D].青島:中國海洋大學，2012.

[3] 初樂,趙巖,周元忻,等.超臨界CO2萃取大蒜素的研究[J].農產品加工(學刊)，2013(3):33-34,40.

[4] 王紅慶,余榮珍.火焰原子吸收法測定大蒜中的微量元素[J].湖北農業科學,2009,48(9):2242-2243.

[5] 楊瑾,陳堅,李新霞,等.高效液相衍生化法測定大蒜氨基酸指紋圖譜[J].新疆醫科大學學報,2010,33(5):509-511.

[6] 賈玉山,格根圖,董占元,等.大蒜調控肉牛免疫功能研究[J].中國飼料，2004(9):13-16.

[7] BALASENTHIL S,RAO K S,NAGINI S.Altered cytokeratin expression during chemoprevention of experimental hamster buccal pouch carcinogenesis by garlic [J].J Oral Pathol Med ,2002,31(3):142.

[8] 李巖，王美惠，吳素琴，等.黑大蒜提物對高脂血癥大鼠血脂的作用、抗氧化活性及對免疫功能的影響[J].內蒙古民族大學學報(自然科學版)，2014(2)：193-197.

[9] 王家埔,于克學,高翠希.大蒜油提取與應用研究現狀[J].保鮮與加工,2002,2(4):11-12.

[10] 晃芳芳,李森.大蒜油不同加工工藝的比較[J].西北糧油科技,2003(4):47-48.

[11] 陳海魁.大蒜素提取工藝的研究[J].安徽農業科學，2014(30)：10637-10639.

[12] 張民,張倩娟,劉玉柱,等.HPLC法測定大蒜中蒜氨酸和大蒜素的含量[J].食品與發酵工業，2009,35(2):156-158.

Detection of Allicin Content in Garlics by High Performance Liquid Chromatography

HAN Gui-zhi,WANG Wen-jun,WANG Fang

(School of Public Health，Jining Medical College,Jining,Shandong 272013)

Key wordsEthanol; Ethyl acetate; Allicin; Extraction time optimization

Abstract[Objective] To establish an analytical method to detect the content of allicin in garlics based on the optimization of extractant selection,dosage and extraction time.[Method] After comminution and enzymolysis of garlics,ethanol and ethyl acetate were used as the extractants to prepare allicin solution.Allicin content was analyzed by high performance liquid chromatograph,so as to determine the optimal extractants.By comparing the extracts detection of different periods,the optimal extraction time was obtained.[Result] The average concentration of allicin reached 28.85 μg/mL with ethanol as the extractant; and the average concentration of allicin was 13.24 μg/mL in ethyl acetate extraction group.Based on comparison,the optimal extraction time was 3.0 h for the extraction of allicin by ethanol.[Conclusion] As a commonly used laboratory chemical reagent,ethanol had the advantages of low toxicity,no pollution and high efficiency.This research provides references for the development and utilization of allicin extraction in laboratory for medicine and food.

基金項目濟寧市科技局項目(2013jnwk74)。

作者簡介韓貴芝(1986- ),女，山東臨沂人，助理實驗師，碩士，從事食品毒理研究。 *通訊作者，副教授，從事公共衛生方面研究。

收稿日期2016-01-04

中圖分類號S 41-33

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)07-057-02