貝母內(nèi)生真菌研究進(jìn)展

許 勇， 張 爽， 程孝中，蔡 標(biāo)， 李 舜， 董朝陽(yáng)*

(1．安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，安徽合肥 230061；2.亳州學(xué)院，安徽亳州 236800)

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貝母內(nèi)生真菌研究進(jìn)展

許 勇1， 張 爽1， 程孝中2，蔡 標(biāo)1， 李 舜1， 董朝陽(yáng)1*

(1．安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，安徽合肥 230061；2.亳州學(xué)院，安徽亳州 236800)

對(duì)貝母中的活性成分、貝母內(nèi)生真菌的多樣性以及產(chǎn)物、貝母內(nèi)生真菌發(fā)酵條件等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，貝母中主要的活性成分為生物堿，其內(nèi)生真菌種類具有多樣性，其中可篩選出可以產(chǎn)生活性生物堿的菌株，這些菌株的篩選、鑒定、發(fā)酵條件探索及代謝產(chǎn)物的分離提純是研究熱點(diǎn)。

貝母；內(nèi)生真菌；活性成分；多樣性；發(fā)酵條件

貝母(Fritilariaanhuiensis)為多年生草本植物，鱗莖可以作為藥用，具有止咳化痰、清熱散結(jié)等功效。按照貝母不同產(chǎn)地和種類可以劃分為川貝母(Fritillariapraewalskiimaxim ex Batal)、浙貝母(Fritillariathunbergii)、平貝母(FritillariaussuriensisMaxim)和皖貝母(FritillariaanhuiensisS.C.Chen et S.P.Yin)等。川貝母味苦、甘,性寒，歸肺、心經(jīng),具有化痰止咳、清熱散結(jié)、潤(rùn)肺養(yǎng)肺的功效[1]。浙貝味苦而性寒，入心肺經(jīng)，能緩解支氣管平滑肌痙攣，具有清熱化痰、散結(jié)解毒、降低血壓、興奮子宮等多種藥理作用[2]。皖貝母為百合科貝母屬藥用植物,以鱗莖入藥,具有清熱、化痰、止咳鎮(zhèn)喘等功效[3]。貝母內(nèi)生真菌具有豐富的多樣性，貝母內(nèi)生真菌的變化會(huì)影響貝母的外形、品質(zhì)以及生長(zhǎng)狀態(tài)，貝母內(nèi)生真菌中的色素及活性物質(zhì)具有較高的開發(fā)利用價(jià)值，所以貝母內(nèi)生真菌篩選與鑒定具有重要的意義。該研究對(duì)貝母中的活性成分、貝母內(nèi)生真菌的多樣性以及產(chǎn)物、貝母內(nèi)生真菌發(fā)酵條件等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 貝母中的活性成分

貝母中含有多種生物堿成分，如貝母甲素、貝母乙素、西貝堿等[4]。劉漢珍等[5]采用高效液相色譜法測(cè)得皖貝母中貝母甲素和貝母乙素含量分別達(dá)0.203～0.251和0.472～0.508 mg/mL。劉震東等[6]采用HPLC與通用型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器ELSD聯(lián)用測(cè)定3年生瓦布貝母中西貝堿含量為9.0 μg/g。李清華等[7-8]從皖貝母中分離出浙貝乙素、貝母辛、異浙貝甲素和皖貝甲素4種生物堿，以及β-谷甾醇、胡蘿卜甙等萜類物質(zhì)。王曙等[9]在川貝母中測(cè)定出含量較高的皂苷，并結(jié)合川貝母較強(qiáng)的止咳化痰功效，認(rèn)為皂苷為川貝母中重要的活性成分。

2 貝母內(nèi)生真菌的多樣性

嚴(yán)鑄云等[10]采用純培養(yǎng)法對(duì)不同生長(zhǎng)期的川貝母內(nèi)生真菌鱗莖中的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離和鑒定，分離得到一年生(一棵針)內(nèi)生真菌10株,鑒定為8個(gè)屬; 一年生(一匹葉)內(nèi)生真菌8株,鑒定為7個(gè)屬; 二年生內(nèi)生真菌13株,鑒定為9個(gè)屬; 三年生內(nèi)生真菌48株,鑒定為14個(gè)屬;四年生內(nèi)生真菌11株,鑒定為7個(gè)屬。分離的結(jié)果表明內(nèi)生菌種類多樣，且每個(gè)時(shí)期的生長(zhǎng)種類均不盡相同；其中指輪枝孢屬存在于每一個(gè)生長(zhǎng)期,表明內(nèi)生真菌對(duì)植物也有專一性；隨生長(zhǎng)時(shí)間的增長(zhǎng),內(nèi)生真菌的數(shù)量也在增多，到三年生時(shí)期,內(nèi)生真菌的數(shù)目達(dá)到高峰,四年生時(shí)期時(shí),內(nèi)生真菌數(shù)目減少，說(shuō)明內(nèi)生真菌在這5個(gè)時(shí)期為一個(gè)生理期,四年生時(shí)期完成了整個(gè)生長(zhǎng)過程,所以內(nèi)生真菌數(shù)量減少,又回到了一年生的一顆針時(shí)期。陳鵲[1]探索甘肅貝母內(nèi)生真菌的應(yīng)用價(jià)值，分離得到13株內(nèi)生真菌，其中鐮刀菌屬接骨木鐮刀菌菌株G6 能產(chǎn)生多種生物堿物質(zhì)。楊宇等[11]從皖貝母中分離出被孢霉科被孢霉屬的被孢霉和曲霉科青霉屬的微紫青霉2種真菌。

3 貝母內(nèi)生真菌的產(chǎn)物

3.1 色素 以苯胺類為主的合成色素會(huì)在人體內(nèi)形成致癌物，而天然紅色素資源缺乏，國(guó)內(nèi)經(jīng)常使用的2種有爭(zhēng)議的食品合成色素莧菜紅和胭脂紅至今未能完全被替代。因此利用微生物生產(chǎn)色素，不受資源、環(huán)境和空間的限制，并可通過微生物大規(guī)模的發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)色素，既可降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益，又可避免因原料緊缺造成的環(huán)境破壞，保護(hù)生態(tài)環(huán)境。張輝東等[12]以一株川貝母暗紫貝母的內(nèi)生真菌為出發(fā)菌，經(jīng)超聲波提取得到一種天然紅色素，并對(duì)該色素穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在堿性溶液中比在酸性溶液中穩(wěn)定性好。

3.2 生物堿 高俊杰等[13]利用高效發(fā)酵體系對(duì)Aspergillus sp.BJ7進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)地下鱗莖中分離的BJ7 具有較高的抑菌活性，發(fā)酵9 d時(shí)BJ7的抑菌效果最好；發(fā)酵液分離濃縮后僅在正丁醇層出現(xiàn)抑菌效果，且當(dāng)溫度>50 ℃時(shí)濃縮液失去抑菌活性，其抑菌活性物質(zhì)極性較大且熱不穩(wěn)定，具有產(chǎn)生生物堿的能力。陳鵲[1]從川貝母中分離的菌株A14及菌株G6產(chǎn)生的生物堿成分可以抑制糞腸球菌的生長(zhǎng)，其抑菌圈平均直徑分別為11.60、10.90 mm,效果中等;菌株C4代謝的生物堿成分對(duì)白色念珠菌有明顯的抑制作用,抑菌圈平均直徑為18.30 mm。葉波平等[14]研究浙貝母的新鮮鱗莖貝母內(nèi)生真菌Nectria sp.NO6及其活性代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黃八疊球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、克雷伯氏肺炎桿菌、白色念珠菌和黑曲霉細(xì)菌的生長(zhǎng)以及人結(jié)腸癌細(xì)胞株、人宮頸癌細(xì)胞株等腫瘤細(xì)胞株的增殖具有明顯的抑制作用，并在pH為5～6時(shí)抑菌活性最高。

3.3 甾醇類化合物 陳鵲[1]通過1H-NMR和13C-NMR譜數(shù)據(jù)及MS特征峰從暗紫貝母內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物中檢測(cè)出3種甾醇類化合物。

4 貝母內(nèi)生真菌發(fā)酵條件的探索

殷紅等[15]通過優(yōu)化從平貝母鱗莖中分離出的內(nèi)生真菌菌株Fu7的培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)在豆芽汁基本培養(yǎng)基中添加6%葡萄糖和0.05%尿素,初始pH 6.0時(shí),最適于其菌絲生長(zhǎng);而添加0.10～0.15 g/L尿素、6%～7%葡萄糖,pH 6.0～6.5則有利于西貝素的積累;在相應(yīng)的優(yōu)化條件下,菌絲干重和西貝素含量分別比在基本培養(yǎng)基中提高約155%和77%。

5 結(jié)語(yǔ)

貝母主要的活性成分為生物堿，某些貝母內(nèi)生真菌或其次生代謝產(chǎn)物中含有具有相應(yīng)活性的生物堿。篩選和培養(yǎng)能夠產(chǎn)生活性生物堿的內(nèi)生真菌可以有效解決貝母藥用資源相對(duì)不足、培育困難等問題。目前，貝母中產(chǎn)活性生物堿內(nèi)生真菌的篩選與鑒定研究已相對(duì)成熟，但發(fā)酵條件的探索方面研究尚少，菌種退化是影響內(nèi)生真菌目的產(chǎn)物產(chǎn)量穩(wěn)定的技術(shù)瓶頸，常規(guī)復(fù)壯手段效果并不理想，探索出合適的菌種保存或復(fù)壯方法是亟待解決的問題。

[1] 陳鵲.川貝母內(nèi)生真菌及其次生代謝產(chǎn)物的研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[2] 張明發(fā)，沈雅琴.浙貝母藥理研究進(jìn)展[J].上海醫(yī)藥,2007,28(10):459-461.

[3] 李同根，王康才,羅慶云，等.Ca2+對(duì)皖貝母高溫脅迫下抗逆生理指標(biāo)及光合作用的影響[J].植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào),2012,18(3):765-770.

[4] 陳德昌,王寶琹.中藥對(duì)照品化學(xué)工作手冊(cè)[M].北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2000.

[5] 劉漢珍,戴云志.HPLC法同時(shí)測(cè)定皖貝母兩種生物堿成分含量[J].中國(guó)林副特產(chǎn),2006,12(6):18-20.

[6] 劉震東,王曙.HPLC-ELSD測(cè)定栽培的瓦布貝母中西貝堿[J].華西藥學(xué)雜志,2005,20(3):257-258.

[7] 李清華，吳宗好.安徽貝母生物堿的分離和結(jié)構(gòu)鑒定[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1986,21(10):767-771.

[8]李清華,張連龍.安徽貝母二萜成分的研究[J].中國(guó)中藥雜志,1990,15(3):42-43.

[9]王曙,徐小平.川貝母與其他貝母類藥材總生物堿和總皂苷的含量測(cè)定與比較[J].中國(guó)中藥雜志,2002，27(5):342-344.

[10] 嚴(yán)鑄云，張琦.不同生長(zhǎng)期川貝母內(nèi)生真菌的多樣性[J].華西藥學(xué)雜志,2008,23(5):521-523.

[11] 楊宇,汪學(xué)軍，韋傳寶，等.皖貝母內(nèi)生真菌的初步研究[J].皖西學(xué)院學(xué)報(bào),2011,27(5):8-10.

[12] 張輝東，曾雪麗.暗紫貝母內(nèi)生真菌紅色素的提取及穩(wěn)定性研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,50(18):3815-3818.

[13] 高俊杰，袁小鳳.浙貝母內(nèi)生真菌的分離篩選及抑菌活性菌株Aspergillus sp.BJ7性質(zhì)的初步研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技,2012,19(2):140-142.

[14] 葉波平，張少華.貝母內(nèi)生真菌Nectria sp.NO6及其活性代謝產(chǎn)物的研究[C]//2008年中國(guó)微生物學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集.海口：海南省微生物學(xué)會(huì)，2008.

[15] 殷紅,陳娟麗.貝母內(nèi)生真菌產(chǎn)西貝素發(fā)酵條件的研究[J].西北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,41(2):261-264.

Research Advances of Endophytic Fungus of Fritilaria anhuiensis

XU Yong1,ZHANG Shuang1,CHENG Xiao-zhong2,DONG Zhao-yang1*et al

(1.Anhui Academy of Medical Sciences,Hefei,Anhui 230061; 2.Bozhou University,Bozhou,Anhui 236800)

The research advances of active ingredients inFritilariaanhuiensis, diversity of endophytic fungus and products,fermentation conditions were reviewed.The main active constituent ofFritilariaanhuiensiswas alkaloid.The endophytic fungi species ofFritilariaanhuiensiwas various,and some fungal strains of them could generate active alkaloid.The selection and identification of the fungal strains generating active alkaloid,the exploration of fermentation conditions and the separation and purification of metabolite were research hotspots.

Fritilariaanhuiensis; Endophytic fungus; Active ingredient; Diversity; Fermentation conditions

省衛(wèi)生計(jì)生委中醫(yī)藥科研課題(2014zy46)。

許勇(1984- )，男，安徽合肥人，助理研究員，碩士，從事分子生物學(xué)及生物化學(xué)研究。*通訊作者，副研究員，從事分子微生物學(xué)研究。

2016-09-07

S 567.23+9

A

0517-6611(2016)28-0141-01