蛋白磷酸酶2A調控細胞周期發揮抗腫瘤作用的研究進展

莊群瑛，林育純，林忠寧

蛋白磷酸酶2A調控細胞周期發揮抗腫瘤作用的研究進展

莊群瑛，林育純，林忠寧*

( 廈門大學公共衛生學院，分子疫苗學和分子診斷學國家重點實驗室，福建廈門361102 )

蛋白磷酸酶2A(PP2A)是真核細胞內廣泛表達的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族的主要成員，參與細胞周期、增殖分化及凋亡等過程中信號通路的去磷酸化調控。研究表明，PP2A不同亞基表達調控與人群腫瘤風險存在關聯性；PP2A與細胞周期相關激酶相互作用，二者調控平衡的研究有助于致癌機制的探討和靶向PP2A抗腫瘤作用的探索。本文對PP2A調控細胞周期的研究進行綜述，著重闡述PP2A-B亞基經由細胞周期因子依賴性激酶1(CDK1)調控細胞周期發揮抑癌作用的機制，為腫瘤的化學預防和靶向干預提供理論依據。

蛋白磷酸酶2A；抗癌作用；細胞周期；細胞周期因子依賴性激酶1

腫瘤是由一群具有高度增殖能力的細胞聚集而成，腫瘤細胞不依賴有絲分裂原，而耐受抗有絲分裂原，其通過促進細胞有絲分裂信號驅動生長和分裂來實現腫瘤細胞的增殖。靶向腫瘤細胞有絲分裂退出從而誘導細胞周期阻滯是目前多種腫瘤化療藥物抗腫瘤作用的機制之一，細胞周期的相關調控分子被認為是抗腫瘤治療的有效靶點。對細胞周期的研究發現，有絲分裂的成功完成需要多種蛋白磷酸酶[1]。其中，蛋白磷酸酶2A (protein phosphatase 2A，PP2A)能通過去磷酸化有絲分裂過程中相關激酶發揮活性功能。近年來，PP2A不同亞基表達調控與人群腫瘤易感性的關系[2]，以及通過與細胞周期相關激酶相互調控發揮抗腫瘤作用[3]的研究得到廣泛關注。本文對PP2A調控細胞周期的研究進行綜述，重點闡述PP2A-B亞基與細胞周期因子依賴性激酶1(cyclin-dependent kinase 1，CDK1)相互作用調控細胞周期的機制，由此提示PP2A通過調控細胞周期發揮抗腫瘤作用，旨在為腫瘤的靶向干預提供理論依據。

1　PP2A及其亞基的表達調控與腫瘤的關聯

PP2A是真核細胞內廣泛表達的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族的主要成員，在去磷酸化底物分子及調節大多數細胞事件和生物過程中起關鍵性作用，包括細胞周期、DNA復制、轉錄和翻譯、信號轉導、細胞增殖和凋亡，在腫瘤形成中發揮重要的生物學功能[4]。研究表明，PP2A能夠調控c-Myc、Rb、p53等細胞周期相關蛋白或酶的活性[5-7]，通過對信號通路中這些底物分子的去磷酸化作用，介導蛋白或酶活性的相應變化，從而參與致癌過程以及腫瘤細胞的增殖和轉歸。

PP2A是由不同亞基組成的結構復合體，其在細胞內生理功能的發揮有賴于各亞基的正常轉錄和表達[8]。其中，二聚體形式(PP2AD) 被認為是核心酶，包括支架A亞基和催化C亞基；三聚體形式(PP2AT) 是活躍的全酶復合物，由A、C亞基和不同的調控B亞基組成。PP2A-B亞基呈結構多樣性，被分為4個不同的家族：B(B55/PR55)、B′(B56/PR61)、B′′(PR48/PR72/PR130)和B′′′(PR93/PR110)，這些家族成員在不同發育階段表達情況不同并具有組織特異性[9]。不同的B亞基成員決定了PP2A全酶對不同底物的選擇性、靶向特異性及其細胞內定位和活性，從而發揮廣泛的生物學功能，被認為可能是具有時空特異性的靶向調節因子[10]。

PP2A各亞基由不同基因編碼，其轉錄和表達的變異可導致PP2A全酶組成和結構的異常而引起功能學改變和病理損傷[8]。國外研究發現，PP2A不同亞基基因編碼區存在遺傳變異和單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)或單體型，可通過蛋白的錯義突變引起PP2A功能改變，與多種腫瘤危險性存在關聯。其中Wang等[11]最早在原發性肺癌和結腸癌中發現Aβ亞基的PPP2R1B基因編碼區存在18種突變，引發PP2A功能性失活；進而發現該基因G298→A的SNP在乳腺癌病人中頻率明顯高于對照組，導致Aβ亞基與B56γ調節亞基結合作用的降低。Chen等[12]發現Aα亞基基因各突變體不具有顯性失活的功能，在細胞內的表達并未誘導人胚胎腎上皮細胞轉化的活力；但隨后使細胞處于半合子突變狀態，發現通過單倍不足機制介導的Aα亞基表達抑制與腫瘤發生和細胞轉歸密切相關。由此提示PP2A亞基的轉錄和表達水平的調控在影響細胞功能活性中起重要作用，與腫瘤發生具有關聯性。

近年來我們的系列研究關注于PP2A的A亞基與不同B亞基的基因調控區，包括5′側翼端的啟動子區(5′PR)和3′非翻譯區(3′UTR)的SNPs及其單體型對基因轉錄和表達的影響；獲得了中國漢族人群相關PP2A亞基基因(如PPP2R1A，PPP2R2D等)5′PR和3′UTR特定位點的SNP及其單體型分布，并通過病例-對照研究探討了與原發性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)風險的關聯性[2]；進一步研究發現PP2A的支架Aα亞基、調節B亞基的B55δ、B55α和B56γ等不同亞基表達調控可影響外源性化合物AFB1、CdCl2等誘導的人肝L02細胞株的毒性作用；并發現外源受試物分別經由PP2A-Aα、-B56γ、-B55δ調控的核因子NF-κB、孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)或miR-133b等介導的信號通路，參與了細胞周期調節、肝細胞毒性誘導及肝癌細胞轉歸等過程[13]。我們最新研究發現，PP2A-B亞基3′UTR多態性是人群HCC治療敏感性不同的潛在原因之一。因此，探索B亞基對致癌過程的調控及其抗腫瘤機制，有利于探討PP2A作為腫瘤預防及治療敏感性靶點的實際意義。

2　PP2A-B亞基調控細胞周期

PP2A-B亞基被認為是其調控細胞周期發揮抗腫瘤作用的關鍵亞基[14]。細胞周期過程中的許多蛋白，例如Cdc25、Wee1、Cdc6、DNA引物酶、TAU和Cyclin G2都受到PP2A-B亞基的調控，B亞基與細胞周期調控息息相關[9]。研究表明，酵母Cdc55(在人類為B55)是胞質分裂所必要的；突變或耗竭Cdc55產生異常不受控制的細胞，表現為細胞分裂的部分阻滯[15]。條件性敲除纖維母細胞中的B55，使其無法去磷酸化波形蛋白，導致間期動態分化和遷移的改變[16]。B′(B56/PR61)家族中的B56α亞型在細胞周期G1期后期，可通過Cyclin G調控p53和通過后期促進復合物/細胞周期體(APC/C)組分調控Wnt信號通路[17]。體外過表達B′′(PR48/PR72/PR130)可以阻滯細胞在G1期，從而抑制細胞周期進程[18]。

自從1989年發現岡田酸(Okadaic acid，OA)抑制PP2A可使M期提前，許多研究均驗證了這一發現。Krasinska等[19]證明了PP2A可通過CDK1活性與有絲分裂激酶活性的相互反作用，使得S期和M期有效地分開，在兩個不同時相中保持動態轉換。但OA并非PP2A特異性的抑制劑，不能區分PP2A的不同形式。近年來，關于有絲分裂中抑制PP2A-B55的高特異性機制研究部分解釋了OA的作用并進一步明確了PP2A-B55的底物。

理論上，PP2A-B55有4種顯著候選的特異性底物。首先，也是最重要的是Wee1和Cdc25，但尚不清楚它們是否僅被PP2A-B55去磷酸化。Hunt[9]采用PP2A-B55耗竭實驗得出，該酶可通過影響Wee1和Cdc25，或者APC/C，來控制CDK1活性，所以在無PP2A-B55的情況下，CDK1活性并未全部喪失，Cyclin B/CDK1復合物進入胞核，并在胞核內激活核膜分解和紡錘體裝配，這解釋了快速進入有絲分裂及有絲分裂維持的原因。其次，長城激酶(greatwall，Gwl)本身是PP2A-B55的一個直接或間接催化底物。2004年，Gwl作為一種新的激酶被發現，在促進有絲分裂的進入與維持有絲分裂的狀態中發揮關鍵作用[20]。Vigneron團隊把Gwl最終可能的催化分子指向PP2A[21]； Castilho課題組隨后將Gwl的催化分子精確為PP2A-B55[22]。研究發現，Gwl磷酸化兩個小調節蛋白，α-內磺肽(Ensa)和環磷酸腺苷調控的磷蛋白19(Arpp19)，然后結合到PP2A-B55上發揮抑制作用[23]；因此，Gwl并非直接調控PP2A-B55。在該自動調節環路中，Gwl通過Ensa和Arpp19誘導抑制PP2A-B55，從而通過抑制Wee1、激活Cdc25而活化CDK1，使其有效地磷酸化下游有絲分裂的相關蛋白。最后，許多CDK1的有絲分裂底物很可能也是PP2A-B55的作用底物。

近來的研究表明，PP2A-B55的不同亞型在不同細胞或不同條件下可能作為與CDK1反作用的磷酸酶發揮功能[24]。質譜分析人宮頸癌HeLa細胞顯示，B55α Ser167位的磷酸化在有絲分裂期尤其活躍；同時，Ser167是CDK1底物結構域(Ser-Pro-X-Arg)中的一部分，提示CDK1與PP2A-B55α存在潛在的反饋調節[25]。此外，Mochida等[26]的研究也發現，包含B55δ調節亞基的PP2A合酶能拮抗CDK1的作用。將非洲爪蟾蜍卵提取物的B55δ耗竭，促進有絲分裂的進入而抵抗其退出；相反地，額外加入純化的PP2A-B55δ復合物，通過Wee1依賴的CDK1磷酸化，可延緩和阻斷CDK1活化，劑量依賴性地減慢有絲分裂的啟動。

PP2A去磷酸化動態調控細胞間期和有絲分裂期平衡的過程，被比喻成日本泉水shishi-odoshi[19]，這種細胞周期的調節機制可能被用于今后腫瘤的基因靶向性治療。

3　PP2A-B亞基調控細胞周期機制應用于抗腫瘤治療

PP2A作為一個腫瘤治療的潛在靶點，近年來逐漸受到關注。許多PP2A的抑制劑和激動劑進入到臨床試驗。LB100是現處于臨床I期試驗階段的水溶性PP2A抑制劑。研究發現，LB100可以增加卵巢癌細胞對于順鉑治療的敏感性[27]。Bai等[28]也證實LB100抑制PP2A可以提高肝細胞癌化學治療的細胞毒性。Lv等[29]的研究團隊發現，LB100單獨或者與輻照聯合作用于鼻咽癌CNE1和CNE2細胞，通過抑制PP2A，增加CDK1活性，從而應對DNA損傷后進入G2/M期，提示LB100可以提高鼻咽癌輻照治療的有效性和降低治療成本。最新的研究發現，應用非特異性抑制劑斑蝥素或OA抑制PP2A后，能經由JNK/SP-1信號通路下調CDK1的表達，導致人胰腺癌細胞阻滯于G2/M期[30]。FTY-720是美國FDA批準的用于治療多發性硬化癥的藥物，具有包括激活PP2A在內的多種作用模式；可通過活化PP2A誘導胰腺癌細胞凋亡，增加達沙替尼的抗腫瘤活性[31]；在乳腺癌早期，PP2A抑制導致了不良預后和阿霉素耐藥，FTY-720可激活PP2A發揮潛在的治療作用[32]。研究提示，這些PP2A抑制劑和激動劑，通過調控PP2A活性，改變癌細胞周期的平衡，從而影響臨床用藥的抗腫瘤療效。

PP2A經由CDK1調控細胞周期應用于腫瘤治療的研究已經比較透徹；然而，確定具體發揮作用的PP2A亞基的研究還比較有限。探明關鍵的PP2A亞基將有助于今后腫瘤特異性靶向治療的應用。PP2A-B亞基決定了其在細胞中不同的調節機制，并在抑制腫瘤轉移中發揮重要作用。在高度轉移性小鼠黑色素瘤BL6細胞中，Ito等[33]發現截短B56γ亞基(△B56γ)，可提高樁蛋白(paxillin)的磷酸化水平，導致細胞死亡增加。過表達△B56γ阻斷了細胞周期檢測點，提高了腫瘤遺傳不穩定性，使得腫瘤從非轉移性向轉移性狀態發展[34]。因此，針對PP2A-B亞基及其抑制劑和底物進行基因操作，將為靶向性抗腫瘤藥物的研發提供策略[9]。

4　小結與展望

作為蛋白磷酸酶，PP2A除了與上述CDK1相互作用外，有研究報道PP2A與細胞周期依賴性激酶CDK2，以及與細胞周期調控激酶Plk1、ATM、ATR、Chk1和Chk2等均存在相互調控的關系。如最新研究發現，PP2A-B55α介導PP2A/Plk1結合與Plk1去磷酸化，二者的結合在DNA損傷后以ATM/ATR和Chks依賴的方式增加[35]。這些細胞周期相關激酶與PP2A相互作用，從而維持機體內環境和細胞周期循環的穩態。在已有的研究中，PP2A與細胞周期相關激酶在細胞周期中相互調控的機制得到了較好的闡述，但關于在其中發揮作用的PP2A具體亞基的研究仍十分有限。此外，在接受外源性刺激后，PP2A可經由不同通路與CDKs相互作用，調控不同細胞周期時相的阻滯情況；然而，對于外源化學物或者抗腫瘤藥物，是否能夠經由二者平衡調控從而在致癌過程或抗腫瘤效應中發揮作用仍尚未明確。因此，進一步開展該領域的研究將為腫瘤的化學預防與靶向PP2A的特異性治療提供理論依據。

[1] Chen F，Archambault V，Kar A，et al. Multiple protein phosphatases are required for mitosis in Drosophila[J]. Curr Biol，2007，17(4)：293-303.

[2] Chen HF，Mai JR，Wan JX，et al. Role of a novel functional variant in the PPP2R1A promoter on the regulation of PP2A-A alpha and the risk of hepatocellular carcinoma[J]. PLoS One，2013，8(3)：59574.

[3] Janssens V，Goris J，Van Hoof C. PP2A：the expected tumor suppressor[J]. Curr Opin Genet Dev，2005，15(1)：34-41.

[4] Alberts AS，Thorburn AM，Shenolikar S，et al. Regulation of cell cycle progression and nuclear affinity of the retinoblastoma protein by protein phosphatases[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1993，90(2)：388-392.

[5] Moule MG，Collins CH，McCormick F，et al. Role for PP2A in ARF signaling to p53[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(39)：14063-14066.

[6] Yeh E，Cunningham M，Arnold H，et al. A signalling pathway controlling c-Myc degradation that impacts oncogenic transformation of human cells[J]. Nat Cell Biol，2004，6(4)：308-318.

[7] Vuocolo S，Purev E，Zhang D，et al. Protein phosphatase 2A associates with Rb2/p130 and mediates retinoic acid-induced growth suppression of ovarian carcinoma cells[J]. J Biol Chem，2003，278 (43)：41881-41889.

[8] Xu Y，Xing Y，Chen Y，et al. Structure of the protein phosphatase 2A holoenzyme[J]. Cell，2006，127(6)：1239-1251.

[9] Hunt T. On the regulation of protein phosphatase 2A and its role in controlling entry into and exit from mitosis[J]. Adv Biol Regul，2013，53(2)：173-178.

[10] Zolnierowicz S，Csortos C，Bondor J，et al. Diversity in the regulatory B-subunits of protein phosphatase 2A：identification of a novel isoform highly expressed in brain[J]. Biochemistry，1994，33(39)：11858-11867.

[11] Wang SS，Esplin ED，Li JL，et al. Alterations of the PPP2R1B gene in human lung and colon cancer[J]. Science，1998，282(5387)：284-287.

[12] Chen W，Arroyo JD，Timmons JC，et al. Cancer-associated PP2A-A alpha subunits induce functional haploinsufficiency and tumorigenicity [J]. Cancer Res，2005，65(18)：8183-8192.

[13] 林麗娜，林育純，陳慧峰，等. PP2A-B56γ高表達抑制鎘誘導的人肝L02細胞DNA損傷[J]. 癌 變·畸變·突變，2012，24(3)：189-194.

[14] Kalev P，Sablina AA. Protein phosphatase 2A as a potential target for anticancer therapy[J]. Anticancer Agents Med Chem，2011，11(1)：38-46.

[15] Healy AM，Zolnierowicz S，Stapleton AE，et al. Cdc55，a saccharomyces-cerevisiae gene involved in cellular morphogenesis：identification，characterization，and homology to the B-subunit of mammalian type-2a protein phosphatase[J]. Mol Cell Biol，1991，11(11)：5767-5780.

[16] Turowski P ，Myles T ，Hemmings B A，et a l. V imentin d ephosphorylation by protein phosphatase 2A is modulated by the targeting subunit B55[J]. Mol Biol Cell，1999，10(6)：1997-2015.

[17] Seeling JM，Miller JR，Gil R，et al. Regulation of beta-catenin signaling by the B56 subunit of protein phosphatase 2A[J]. Science，1999，283(5410)：2089-2091.

[18] Seshacharyulu P，Pandey P，Datta K，et al. Phosphatase：PP2A structural importance，regulation and its aberrant expression in cancer [J]. Cancer Lett，2013，335(1)：9-18.

[19] Krasinska L，Domingo-Sananes MR，Kapuy O，et al. Protein phosphatase 2A controls the order and dynamics of cell-cycle transitions [J]. Mol Cell，2011，44(3)：437-450.

[20] Yu JT，Fleming SL，Williams B，et al. Greatwall kinase：a nuclear protein required for proper chromosome condensation and mitotic progression in Drosophila[J]. J Cell Biol，2004，164(4)：487-492.

[21] Vigneron S，Brioudes E，Burgess A，et al. Greatwall maintains mitosis through regulation of PP2A[J]. EMBO J，2009，28(18)：2786-2793.

[22] Castilho PV，Williams BC，Mochida S，et al. The M phase kinase greatwall (Gwl) promotes inactivation of PP2A/B55 delta，a phosphatase directed against CDK phosphosites[J]. Mol Biol Cell，2009，20(22)：4777-4789.

[23] Mochida S，Maslen SL，Skehel M，et al. Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A：That is essential for mitosis[J]. Science，2010，330(6011)：1670-1673.

[24] Jeong AL，Yang Y. PP2A function toward mitotic kinases and substrates during the cell cycle[J]. Bmb Reports，2013，46(6)：289-294.

[25] Schmitz MH，Held M，Janssens V，et al. Live-cell imaging RNAi screen identifies PP2A-B55 alpha and importin-beta 1 as key mitotic exit regulators in human cells[J]. Nat Cell Biol，2010，12(9)：886-893.

[26] Mochida S，Ikeo S，Gannon J，et al. Regulated activity of PP2A-B55 delta is crucial for controlling entry into and exit from mitosis in Xenopus egg extracts[J]. EMBO J，2009，28(18)：2777-2785.

[27] Chang KE，Wei BR，Madigan JP，et al. The protein phosphatase 2A

inhibitor LB100 sensitizes ovarian carcinoma cells to cisplatin-mediated cytotoxicity[J]. Mol Cancer Ther，2015，14(1)：90-100.

[28] Bai XL，Zhang Q，Ye LY，et al. Inhibition of protein phosphatase 2A enhances cytotoxicity and accessibility of chemotherapeutic drugs to hepatocellular carcinomas[J]. Mol Cancer Ther，2014，13(8)：2062-2072.

[29] Lv P，Wang Y，Ma J，et al. Inhibition of protein phosphatase 2A with a small molecule LB100 radiosensitizes nasopharyngeal carcinoma xenografts by inducing mitotic catastrophe and blocking DNA damage repair[J]. Oncotarget，2014，5(17)：7512-7524.

[30] Gong FR，Wu MY，Shen M，et al. PP2A inhibitors arrest G2/M transition through JNK/Sp1-dependent down-regulation of CDK1 and autophagy-dependent up-regulation of p21[J]. Oncotarget，2015，6(21)：18469-18483.

[31] Chien W，Sun QY，Lee KL，et al. Activation of protein phosphatase 2A tumor suppressor as potential treatment of pancreatic cancer[J]. Mol Oncol，2015，9(4)：889-905.

[32] Rincon R，Cristobal I，Zazo S，et al. PP2A inhibition determines poor outcome and doxorubicin resistance in early breast cancer and its activation shows promising therapeutic effects[J]. Oncotarget，2015，6(6)：4299-4314.

[33] Ito A，Kataoka TR，Watanabe M，et al. A truncated isoform of the PP2A B56 subunit promotes cell motility through paxillin phosphorylation[J]. EMBO J，2000，19(4)：562-571.

[34] Ito A，Koma Y，Watabe K，et al. A truncated isoform of the protein phosphatase 2A b56 gamma regulatory subunit may promote genetic instability and cause tumor progression[J]. Am J Pathol，2003，162 (1)：81-91.

[35] Wang L，Guo Q，Fisher LA，et al. Regulation of polo-like kinase 1 by DNA damage and PP2A/B55 alpha[J]. Cell Cycle，2015，14(1)：157-166.

R730.231

A

1004-616X(2016)02-0155-04

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.02.016

2015-11-20；

2016-01-18

國家自然科學基金(81172705，81472997，81573181)；973計劃前期研究專項(2014CB560710)；福建省自然科學基金項目(2014J 01372，2015J01344)；廈門大學山海基金項目(2013SH007)

作者信息： 莊群瑛，E-mail：672678722@qq.com。*

，林忠寧，E-mail：linzhn@xmu.edu.cn