實(shí)驗(yàn)教學(xué)改進(jìn)：血藥濃度法估算家兔口服對(duì)乙酰氨基酚藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

謝寶剛　劉愛紅　趙天生　賴小平

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實(shí)驗(yàn)教學(xué)改進(jìn)：血藥濃度法估算家兔口服對(duì)乙酰氨基酚藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

謝寶剛1劉愛紅2趙天生3賴小平3

【摘要】血藥濃度法估算口服對(duì)乙酰氨基酚藥動(dòng)學(xué)參數(shù)是我校藥學(xué)專業(yè)生物藥劑學(xué)與藥物動(dòng)力學(xué)課程主要的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容之一。本文就給藥后取血、樣品前處理及血藥濃度測(cè)定方法對(duì)原實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了改進(jìn)。結(jié)果表明，相對(duì)于原實(shí)驗(yàn)方法，改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便、取血順利；利用差示分光光度法測(cè)定血藥濃度可提高分析方法靈敏度，減少干擾因素。改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)方法操作行強(qiáng)，具有較好穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，適合實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

【關(guān)鍵詞】教學(xué)改進(jìn)；血藥濃度法；藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)；差示分光光度法

【中圖分類號(hào)】G642

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

作者單位：1 330006南昌大學(xué)藥學(xué)院；2 330006南昌大學(xué)分析測(cè)試中心；3 330006南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)部

生物藥劑學(xué)與藥物動(dòng)力學(xué)是是藥劑學(xué)的分支學(xué)科，是藥學(xué)專業(yè)的主干專業(yè)課程之一，由生物藥劑學(xué)與藥物動(dòng)力學(xué)兩部分組成，其中，生物藥劑學(xué)是研究藥物及劑型在體內(nèi)的吸收、分布、代謝與排泄（ADME）過程，闡明藥物的劑型因素、機(jī)體生物因素和藥物療效之間相互關(guān)系的科學(xué)；藥物動(dòng)力學(xué)是應(yīng)用動(dòng)力學(xué)的原理與數(shù)學(xué)處理方法，定量描述藥物通過各種途徑進(jìn)入機(jī)體的ADME過程的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的科學(xué)。藥物動(dòng)力學(xué)方法廣泛應(yīng)用于制劑研究和藥物質(zhì)量評(píng)價(jià)、臨床用藥和新藥篩選等方面，是一門實(shí)踐性很強(qiáng)的課程。生物藥劑學(xué)與藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)目的是使學(xué)生更好地掌握基本理論，培養(yǎng)學(xué)生的動(dòng)手能力、發(fā)現(xiàn)問題及解決實(shí)際問題的能力，以提高學(xué)生的綜合素質(zhì)[1-3]。但藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)涉及生物藥劑學(xué)、藥物分析、藥理學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)等多學(xué)科知識(shí)，實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜、影響因素多，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期差距較大，存在實(shí)驗(yàn)效果不理想的情況[4-5]。血藥濃度法估算口服對(duì)乙酰氨基酚藥動(dòng)學(xué)參數(shù)是藥學(xué)相關(guān)專業(yè)主要的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容之一，對(duì)學(xué)生理解并掌握通過血藥濃度的測(cè)定來獲取藥物的藥動(dòng)參數(shù)具有重要指導(dǎo)意義。該實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括血樣的采集、血藥濃度的測(cè)定及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理等步驟。桂卉等[6]改進(jìn)了該實(shí)驗(yàn)血清除蛋白方法，操作簡(jiǎn)便，適合學(xué)生教學(xué)實(shí)驗(yàn)。然而，在學(xué)生實(shí)驗(yàn)的帶教過程中，發(fā)現(xiàn)該實(shí)驗(yàn)還存在取血不方便；測(cè)得的血藥濃度數(shù)據(jù)波動(dòng)范圍大、誤差偏大等現(xiàn)象，最終導(dǎo)致無法較好擬合藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的缺陷。本文就該實(shí)驗(yàn)在家兔取血和血藥濃度測(cè)定等方面對(duì)原實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了改進(jìn)，改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)方法重現(xiàn)性、穩(wěn)定性好，適合學(xué)生教學(xué)實(shí)驗(yàn)，具體報(bào)道如下。

1　原實(shí)驗(yàn)主要步驟和方法[6]

家兔灌服對(duì)乙酰氨基酚片0.5 g后，采用耳靜脈取血，對(duì)血樣加氫氧化鋇、硫酸鋅除蛋白或1.5倍乙腈除蛋白的方法，離心后采用紫外分光光度法在257 nm測(cè)定血藥濃度，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)處理：繪制藥時(shí)曲線、將測(cè)得的血藥濃度代入藥動(dòng)公式求算消除速率常數(shù)K、半衰期t1/2等藥動(dòng)參數(shù)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括血樣的采集、血藥濃度的測(cè)定及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理三部分內(nèi)容。其中對(duì)取血和給藥后血藥濃度的測(cè)定是本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)課應(yīng)完成的操作，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)估算可以在實(shí)驗(yàn)完成后撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告時(shí)獲得。

2　改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)方法

2.1器材與試劑

儀器與材料：分析天平、容量瓶、751分光光度計(jì)、注射器每組2支、動(dòng)脈夾、三通管、止血鉗、眼科手術(shù)剪、具塞試管、10 ml離心管每組8個(gè)、家兔固定箱、刀片、棉球、離心機(jī)，1.0 ml及0.2 ml移液槍每組各一把。藥品與試劑：撲熱息痛（原料藥）、2.5%戊巴比妥、無水或95%乙醇、0.02 M NaOH、肝素鈉 1 mg/ml等。

2.2藥濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取一只兔子，耳靜脈取血大約3.0 ml，放置30 min后3 500 rpm離心10 min，得到無藥血清。分別精密吸取對(duì)乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液（4 mg/ml，水箱保存）0.3 ml、0.60 ml、1.2 ml、1.8 ml、2.5 ml、3.0 ml于10 ml容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，分別得到120、240、480、720、1 000、1 200 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0.3 ml至6支離心試管中，加兔血清0.2 ml，振搖均勻，加2.5 ml乙醇，震蕩搖勻，3 500 rpm離心10 min，每管取上清液2份，每份0.5 ml，其中一份準(zhǔn)確加水4 ml （共4.5 ml），另一份加0.01 M NaOH 4 ml （共4.5 ml）。最后溶液于751型分光光度計(jì)上λ＝265 nm處分別測(cè)得不同溶液稀釋樣品的吸收率（A水和ANaOH），由將所測(cè)得的吸收度△A---C作圖，進(jìn)行回歸分析，得到工作曲線。

2.3藥動(dòng)實(shí)驗(yàn)家兔取血、處理

取家兔一只，體重2～3 kg，雌雄均可，給藥前禁食12 h。腹腔注射戊巴比妥 2.5%1.2 ml/kg進(jìn)行麻醉。藥物起效后，固定家兔，使其頸部拉直。剪毛，割皮，鑷子、止血鉗鈍性分離頸總動(dòng)脈。遠(yuǎn)心端結(jié)扎，近心端用動(dòng)脈夾夾緊，留一根絲線備用。刀柄墊起動(dòng)脈，小剪刀平剪開一斜口，用充滿肝素鈉的三通管進(jìn)行動(dòng)脈插管。動(dòng)脈插管后，家兔導(dǎo)管灌胃對(duì)乙酰氨基酚原料藥0.5 g/只（加1.5 ml水配成混懸劑）。給藥后，按20、30、50、70、90、120、150、180、210、250、300 min，定時(shí)從動(dòng)脈插管取血1.0 ml（先放掉大約1.0 ml管中含肝素的血）。將每次所取血液滴于預(yù)先干燥的刻度離心管中。待所有樣品收集完后，全血3 500 rpm／min離心10 min。用移液槍精密吸取血清（上清）0.2 ml置離心管中。

2.4血藥濃度的測(cè)定及動(dòng)力學(xué)參數(shù)求算

上述血清0.2 ml，再加蒸餾水0.3 ml（總體積0.5 ml），加2.5 ml乙醇，震蕩搖勻，3 500 rpm離心5 min，每管取上清液2份每份1.0 ml，其中一份準(zhǔn)確加水4 ml（共4.5 ml），另一份加0.01 M NaOH加水4 ml（共4.5 ml）。最后溶液于751型分光光度計(jì)上，λ=265 nm處測(cè)得樣品的吸收率，記錄數(shù)據(jù)。

2.5數(shù)據(jù)處理

將各時(shí)刻下測(cè)得的吸收度△A值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線上的回歸方程，計(jì)算出各時(shí)刻下的血藥濃度C（μg/ml）。以血藥濃度C為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，作LogC-t曲線圖。求出K，t1/2，Tmax，Cmax，AUC，Ka和t1/2（a）等藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

3　結(jié)果

3.1家兔耳緣靜脈取血改為頸總動(dòng)脈插管術(shù)取血

耳緣靜脈取血是家兔取血常用的方法，但由于學(xué)生在實(shí)驗(yàn)過程中極易使靜脈血管破裂，加上傷口出血凝固快及造成靜脈栓塞的可能。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兔子耳緣靜脈取血1～2次可行，多次取血無法順利現(xiàn)實(shí)，即使是剪掉兔子的部分耳朵。本實(shí)驗(yàn)亦嘗試首先給家兔注射高劑量的肝素鈉溶液后，再行取血，但結(jié)果仍不太理想。

家兔頸總動(dòng)脈插管術(shù)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)及相關(guān)基礎(chǔ)研究的基本操作和技能，我校藥學(xué)專業(yè)學(xué)生在生理學(xué)實(shí)驗(yàn)和藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)兩門先行課程中均對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)的學(xué)習(xí)和訓(xùn)練，大部分學(xué)生都能獨(dú)立完成家兔頸總動(dòng)脈插管術(shù)。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)原方法中的耳緣靜脈取血改為頸總動(dòng)脈插管取血，結(jié)果表明，采用三通管接細(xì)導(dǎo)管插入家兔頸動(dòng)脈后，取血簡(jiǎn)便易行、靈活方便多次操作，節(jié)時(shí)省力，實(shí)驗(yàn)效果比耳緣靜脈取血好。

3.2血藥濃度測(cè)定方法的改進(jìn)

因紫外分光光度計(jì)操作簡(jiǎn)便、儀器便宜、保養(yǎng)經(jīng)濟(jì)等因素，被廣泛用于學(xué)生實(shí)驗(yàn)中。但該法存在選擇性（專屬性）不強(qiáng)、靈敏度不高等缺陷而可能導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。特別是對(duì)血液樣品而言，眾多的有機(jī)小分子、蛋白等多可能對(duì)測(cè)定結(jié)果有較大的干擾。該實(shí)驗(yàn)原有采用氫氧化鋇＋硫酸鋅、氯化汞等除蛋白的方法，利用重金屬方法除蛋白效果不太理想，且污染環(huán)境，樣品有時(shí)出現(xiàn)乳光，測(cè)定結(jié)果波動(dòng)幅度大、誤差大。文獻(xiàn)報(bào)道[6]，利用1.5倍的乙腈消除血清中的蛋白，操作簡(jiǎn)便，效果較好。但本實(shí)驗(yàn)采用該方法去除蛋白測(cè)定結(jié)果還是顯示重現(xiàn)性差，實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)不同個(gè)體家兔血清及出現(xiàn)的溶血的血清等都對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較大。

該實(shí)驗(yàn)利用分光光度計(jì)測(cè)定家兔血清中對(duì)乙酰氨基酚濃度方法靈敏度較低、影響因素多、經(jīng)常出現(xiàn)測(cè)定結(jié)果波動(dòng)幅度大誤差大的現(xiàn)象。因此，我們認(rèn)為在保證除盡血清中蛋白等大分子物質(zhì)的基礎(chǔ)上，關(guān)鍵是提高測(cè)定方法的靈敏度。差示分光光度法改用濃度比樣品稍低或稍高的標(biāo)準(zhǔn)溶液代替空白試劑來調(diào)節(jié)儀器的透光率以提高分光光度法精密度、準(zhǔn)確度和靈敏度。一般分光光度法其濃度測(cè)量的相對(duì)誤差在1%～3%，如采用示差分光度法測(cè)量，則誤差往往可減少到千分之幾。參考相關(guān)文獻(xiàn)[7-9]，本實(shí)驗(yàn)以上述標(biāo)準(zhǔn)曲線中的一個(gè)樣品（13 μg/ml）為研究對(duì)象，分別以0.01 M氫氧化鈉溶液和水為基質(zhì)配制得到的對(duì)乙酰氨基酚溶液，以水配乙酰氨基酚溶液作參比，在200～350 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)處掃描，得到△A曲線。結(jié)果顯示在0.01 M氫氧化鈉溶液中對(duì)乙酰氨基酚的△A曲線顯示在265 nm 的波長(zhǎng)處有最大吸收差值，見圖1。 因此選用0.01 M氫氧化鈉溶液和水作配制（或稀釋）乙酰氨基酚（血清）樣品的介質(zhì)。

3.3差示分光光度法測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證

按照上述方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品在265 nm測(cè)定△A值對(duì)濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸，得回歸方程：△A=0.027 c-0.004 5 R2=0.988 9，表明對(duì)乙酰氨基酚在1.3～13 μg范圍內(nèi)與△A呈良好的線性關(guān)系。本次研究結(jié)果顯示，血清樣品按上述方法預(yù)處理后，同一份樣品在6 h內(nèi)重復(fù)測(cè)定5次，△A相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于5%，表明樣品在實(shí)驗(yàn)過程中穩(wěn)定，預(yù)處理方法簡(jiǎn)便可行。考慮到乙腈的潛在毒性及成本，本實(shí)驗(yàn)在樣品前處理沉淀蛋白的過程中，采用乙醇替換文獻(xiàn)[6]中的乙腈；另外改用差示分光光度法測(cè)定血清中的對(duì)乙酰氨基酚，該法可以在很大程度上消除干擾組分和背景吸收，提高分析方法的靈敏度。

3.4藥動(dòng)曲線結(jié)果

用改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，繪制的藥時(shí)曲線，見圖2。結(jié)果顯示，對(duì)乙酰氨基酚在在家兔體內(nèi)的口服給藥基本符合一室動(dòng)力學(xué)模型，最大吸收時(shí)間tmax介于50～90 min，90 min后對(duì)乙酰氨基酚基本處在清除期，240 min血藥濃度下降到最大濃度的1/10以下，因此該實(shí)驗(yàn)可在240 min內(nèi)完成采血9～11次（吸收相，最大吸收點(diǎn)，清除相分別3～4個(gè)時(shí)間點(diǎn)），獲得藥物的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

圖1　對(duì)乙酰氨基酚差示光譜圖

圖2　血藥濃度-時(shí)間曲線

4　 討論

血藥濃度法估算口服對(duì)乙酰氨基酚藥動(dòng)學(xué)參數(shù)是藥學(xué)專業(yè)生物藥劑學(xué)與藥物動(dòng)力學(xué)課程主要的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容之一，對(duì)于學(xué)生理解藥物的藥動(dòng)參數(shù)具有重要指導(dǎo)意義。其中，動(dòng)物在給藥后順利取血及血藥濃度的準(zhǔn)確測(cè)定是該實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。本文在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，綜合考慮學(xué)生實(shí)驗(yàn)技術(shù)水平，儀器材料價(jià)廉易得、安全，實(shí)驗(yàn)時(shí)間適中等多方面因素。對(duì)家兔取血方法，樣品前處理及分析測(cè)試方法等進(jìn)行了改進(jìn)，實(shí)踐證明，相對(duì)于以前的實(shí)驗(yàn)方法，改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便、取血順利；差示紫外分光光度法極大的提高了分析的靈敏度，降低了干擾因素。

總之，改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)方法操作行強(qiáng)，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定性與重現(xiàn)性均好，總體實(shí)驗(yàn)時(shí)間適中，更適合學(xué)生教學(xué)實(shí)驗(yàn)。

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Improvement of the Laboratory Teaching Course: Estimation of Orally Pharmacokinetic Parameters of Paracetamol in Rabbits

XIE Baogang1LIU Aihong2ZHAO Tiansheng3LAI Xiaoping31 Pharmacy College of Nanchang University, Nanchang 330006, China. 2 Forecasting and Analysis Center of Nanchang University, Nanchang 330006, China. 3 Deaprtment of Experiment Teaching Administration, Nanchang University, Nanchang 330006, China

[Abstract]Estimation of orally pharmacokinetic parameters of paracetamol by blood method in rabbits is one of the major experiments in the laboratory teaching course on bio-pharmaceutics and pharmacokinetics in pharmaceutical specialty. In this study, the method of obtaining plasma samples, sample preparation, and the assay for determining paracetamol in blood were optimized and improved. Our results showed that the improved method is simple and reliable for obtaining blood samples and pre-treatment, the differential ultraviolet spectrophotometric assay could significantly enhance the sensitivity of measuring analyte in blood. The improved experiment method was demonstrated to be good stability and reproducibility, which is suitable for student experiment in laboratory teaching course.

[Key words]Teaching improvement, Blood drug concentration method, Pharmacokinetic experiment, Differential ultraviolet spectrophotometric assay

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2016.02.020

【文章編號(hào)】1674-9308（2016）02-0031-03