蜂膠中蘆丁和槲皮素的含量及抗氧化性能研究

王春玲（齊魯師范學院生命科學學院，山東濟南250013）

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蜂膠中蘆丁和槲皮素的含量及抗氧化性能研究

王春玲
（齊魯師范學院生命科學學院，山東濟南250013）

摘要：用高效液相色譜對蜂膠乙醇提取物（EEP）中的蘆丁和槲皮素含量進行測定，并對不同處理方法得到的EEP進行抗氧化性能研究。結果表明，蘆丁和槲皮素在不同試驗樣品的含量分別為：粗蜂膠中的含量分別是1.823 %和6.03 %，超聲波輔助乙醇提取物中的含量分別為3.134%和6.138%，經(jīng)大孔樹脂純化后其含量分別為4.256 %和13.483 %。通過Schaal烘箱法表明蜂膠中黃酮類化合物含量越高，抗氧化效果越好。

關鍵詞：蘆丁；槲皮素；高效液相色譜；抗氧化性能

蜂膠是蜜蜂用來防護、抵御病蟲害和病原微生物入侵巢房的御敵物質，同時也是作為修補巢房和內(nèi)環(huán)境消毒殺菌的一種特殊物質[1-2]。蜂膠的化學組成特征是含有多種類黃酮化合物，蜂膠因此被稱為“黃酮類化合物的寶庫”[3]，蜂膠的大部分生理及藥理功能都與此類物質有密切關系[4]。

從20世紀60年代以來，人們對黃酮或酚類化合物的抗氧化性質，特別是其在食用油脂中的抗氧化活性做了大量研究[5－9]。Ozcan等[10]用蜂膠的甲醇提取物（濃度從0.02 %~0.08 %）加入到橄欖油中，在60℃貯存，結果表明蜂膠甲醇提取物的濃度在0.06 %和0.08 %時的抗氧化作用要好于0.01 %的BHA和BHT。

從20世紀50年代末，隨著各種色譜分離技術的迅速發(fā)展與質譜新技術的出現(xiàn)，使蜂膠的化學成分研究迅速發(fā)展，目前世界各地蜂膠樣品中分離出來的黃酮類化合物已有70多種。蜂膠中的黃酮類化合物主要包括黃酮醇類、黃酮類和黃烷酮類。常見的黃酮醇類有高良姜素、槲皮素、蘆丁、楊梅酮、山奈酚，黃酮類有芹菜素、白楊黃素，黃烷酮類有生松素等[11-13]。隨著氣質聯(lián)用、核磁共振等現(xiàn)代分析新技術的發(fā)展，近年來國內(nèi)外科學家又鑒定出上百種蜂膠新成分[14-16]。

作者前期已對蜂膠中黃酮類化合物的提取、純化及抗氧化性能進行過相關研究，在此進一步用高效液相色譜對不同處理方法得到的蜂膠產(chǎn)品中的蘆丁和槲皮素進行分離鑒定，并驗證蜂膠中黃酮類化合物含量與抗氧化性能的相關性，以期為開發(fā)蜂膠產(chǎn)品作為天然食品添加劑提供一定的理論參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要材料

蜂膠：購自河南福美蜂產(chǎn)品有限公司；蘆丁標準品、槲皮素標準品：中國藥品生物制品檢定所；豬油（新鮮豬板油）：實驗室熬制，過濾后置冰箱內(nèi)備用。

1.1.2主要試劑

乙醇，氫氧化鈉，硝酸鋁，亞硝酸鈉，異辛烷、冰醋酸，碘化鉀，硫代硫酸鈉，重鉻酸鉀，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，磷酸，可溶性淀粉等（均為AR級）。甲醇（色譜純），重蒸水。

維生素E、茶多酚、特丁基對苯二酚（TBHQ）：均為食用級。

1.2主要儀器

KQ-250超聲波清洗器、RE-52C旋轉蒸發(fā)器、SHZ-D循環(huán)水式真空泵：河南鞏義英峪予華儀器廠；722S分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；101－1干燥箱：上海市實驗儀器總廠；THZ-82B氣浴恒溫振蕩器：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；LC10A高效液相色譜儀、紫外檢測器SPD-10AV、色譜柱：Kromasil－C18柱（0.4×25 cm）：日本島津儀器有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1蜂膠原料處理

將冷凍的粗蜂膠粉碎后過20目篩后存入冰箱中備用，即為粗蜂膠樣品。

1.3.2蜂膠處理方法

將蜂膠原料按超聲波輔助法最佳提取工藝提取得蜂膠超聲波輔助法提取物試驗樣品，再按大孔樹脂最佳純化工藝處理得本次大孔樹脂純化后試驗樣品[17-18]。

1.3.3色譜條件

流動相為65 %甲醇－35 %水（用磷酸調(diào)pH至3）；流速為0.7 mL/min；柱溫40℃；檢測波長為270 nm；進樣量10 μL。

1.3.4標準溶液的制備

蜂膠黃酮類化合物標準溶液：精密稱取蘆丁、槲皮素標樣各7.0 mg于50 mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻備用。

樣品液的制備：稱取蜂膠樣品0.100 g（精確到0.001 g），放入50 mL的容量瓶中，加入40 mL甲醇，在超聲波水浴中振蕩，待樣品溶解后，用甲醇定容，用0.5 μm的濾膜過濾，濾液備用。

1.3.5蜂膠黃酮類化合物的抗氧化性能試驗

1.3.5.1采用Schaal烘箱法

以自制豬油為底物，采用Schaal烘箱法進行測定[19]。

1.3.5.2過氧化值的測定

參照GB/T5538-2005《動植物油脂過氧化值的測定》。

2結果與分析

2.1 HPLC檢測圖譜

采用高效液相色譜法對蘆丁和槲皮素標準品以及各不同處理方法得到的蜂膠樣品掃描得到的圖譜如圖1～4所示。

圖1蘆丁和槲皮素標樣的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard sample of rutin and quercetin

圖2粗蜂膠樣品的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of curde propolis

圖3蜂膠超聲波法提取物的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of ultrasonic ethanol extract of propolis

圖4大孔樹脂純化后的蜂膠產(chǎn)品的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of purified propolis by macroreticular resin

由圖1可以看出，所用的HPLC法可將含有蘆丁和槲皮素標樣的混合物在15 min內(nèi)完全分離。蘆丁和槲皮素標樣在本試驗色譜條件下，色譜基線平直，都呈現(xiàn)單一色譜峰，且峰形對稱，無拖尾現(xiàn)象，雜質也無干擾。蘆丁出峰較早，其保留時間為5.387 min，槲皮素的保留時間為9.673 min。

在黨中央遷往當時北平的路上，毛澤東意味深長地說：這是“進京趕考”。“我們決不當李自成，我們都希望考個好成績！”這考官自然是以工農(nóng)為主體的人民大眾。

由圖2～4可以看出，HPLC可以快速分離蜂膠中的黃酮類化合物。在本試驗色譜條件下，所有的峰基本都被很好的分開。其中粗蜂膠中分離出26種組分；超聲法蜂膠提取物中分離出27種組分；經(jīng)大孔樹脂純化后的蜂膠樣品中分離出23種組分。由于標樣的的原因，只能從中鑒定出蘆丁和槲皮素。從響應值上可以看出，蜂膠的超聲提取物中的黃酮含量要高于粗蜂膠中的黃酮含量，低于純化后的蜂膠樣品的黃酮含量。就蘆丁和槲皮素來說，粗蜂膠中的含量分別是1.823 %和6.03 %，經(jīng)超聲波提取后，含量分別為3.134 %和6.138 %，經(jīng)大孔樹脂純化后其含量分別為4.256 %和13.483 %。

2.2穩(wěn)定性試驗

精密吸取槲皮素和蘆丁標準品溶液，進樣量均為10 μL，注入HPLC色譜儀進行分析，每隔4 h測定一次，總共測16 h，記錄色譜。測定結果見表1。

表1穩(wěn)定性試驗結果Table 1 The results of stability test

槲皮素平均峰面積值為195.48，RSD為0.86 %；蘆丁的平均峰面積值為167.45，RSD為0.92 %。試驗結果表明，本品溶液在16 h內(nèi)基本穩(wěn)定，其峰面積基本不變。

2.3精密度試驗

取混合標準溶液，按上述色譜條件，每次進樣10 μL，連續(xù)進樣5次，以峰面積定量，分別計算蘆丁和槲皮素的R S D在1.25 %～2.79 %，表明該試驗條件下測定各蜂膠樣品中的蘆丁和槲皮素的含量，儀器精密度良好。

2.4抗氧化試驗

前期試驗已研究過蜂膠提取物的抗氧化性能，在此有對純化前后的蜂膠樣品以豬油為底物進行了抗氧化試驗。如圖5，6所示。

由圖5可以看出4種抗氧化劑對豬油的抗氧化性能的大小依次為：TBHQ＞蜂膠＞茶多酚＞維生素E。兩種提取方法得到的蜂膠提取物抗氧化性能相當。

由圖6可以看出，經(jīng)大孔樹脂純化后的蜂膠的抗氧化性能要好于蜂膠粗提物，蜂膠的粗提取物在第11 d時過氧化值已達到22 meg/kg，而經(jīng)純化后的蜂膠提取物在第16天時才達到21 meg/kg，說明蜂膠的純度越高，抗氧化效果越好。這是因為蜂膠經(jīng)過大孔樹脂吸附后，雜質含量減少，蜂膠中的有效成分即黃酮類化合物的含量提高了，單位質量中的總黃酮類化合物含量增加，因此抗氧化效果好。

圖5不同抗氧化劑對豬油氧化穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects on oxidation stability by different antioxidant of lard

圖6純化前后的蜂膠提取物對豬油氧化穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effects on oxidation stability by Before and after purified of propolis

3　結論

1）HPLC法可以快速分離鑒定蜂膠中的黃酮類化合物，在本試驗色譜條件下，蘆丁和槲皮素在不同處理方法下的含量分別為：粗蜂膠中的含量分別是1.823 %和6.03 %，經(jīng)超聲波輔助提取后，含量分別為3.134 %和6.138 %，經(jīng)大孔樹脂純化后其含量分別為4.256 %和13.483 %，大孔樹脂純化效果明顯。由于標樣的關系，只能鑒定出蜂膠樣品中的兩種組分。

2）蜂膠乙醇提取物有良好的抗氧化效果，試驗測得4種抗氧化劑對豬油的抗氧化性能的大小依次為：TBHQ＞蜂膠乙醇提取物＞茶多酚＞VE；純化后的蜂膠提取物的抗氧化效果好于蜂膠粗提物，說明蜂膠中黃酮

類化合物含量越高，抗氧化效果越好。

3）我國蜂膠資源豐富，蜂膠中黃酮類化合物含量很高，而黃酮類化合物是食品中主要的天然抗氧化劑和添加劑。本試驗也證實了蜂膠具有優(yōu)良的抗氧化性能，雖然將蜂膠作為天然抗氧化劑在食品工業(yè)中廣泛使用還有許多工作要做，比如固定的提取方法，急性和慢性毒理學試驗等，但是隨著研究的深入，未來蜂膠一定會成為很有前途的天然抗氧化劑。

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Study on the Content and Antioxidant Properties of Rutin and Quercetin in Propolis

WANG Chun-ling
（School of Life Sciences，Qilu Normal University，Jinan 250013，Shandong，China）

Abstract：The content of rutin and quercetin of ethanol extract of propolis was determined by HPLC，and the antioxidant activity of ethanol extract of EEP was also researched. Analysis showed：the content of rutin and quercetin was 1.823 % and 6.03 % respectively in crude propolis；3.134 % and 6.138 % respectively in ultrasonic assisted ethanol extract of propolis；4.256 % and 13.483 % respectively in purification by macroreticular resin.It showed that the more flavonoids contents of the propolis，the better antioxidant activity by Schaal oven method.

Key words：rutin；quercetin；HPLC；antioxidant activity

收稿日期：2014-05-15

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.010

作者簡介：王春玲（1977—），女（漢），講師，碩士，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。