當歸揮發油分子蒸餾餾分GC-MS分析及抗氧化研究

張慶，茹慶國，林紅梅，李輝，劉艷，吳清北京中醫藥大學，北京 100102

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當歸揮發油分子蒸餾餾分GC-MS分析及抗氧化研究

張慶，茹慶國，林紅梅，李輝，劉艷，吳清
北京中醫藥大學，北京 100102

摘要：目的研究當歸揮發油分子蒸餾后各餾分的化學組成及抗氧化能力。方法用分子蒸餾設備對當歸揮發油進行分餾，采用氣相色譜-質譜法（GC-MS）表征各餾分的化學組成，采用主成分分析法（PCA）分析其化學組成的差異，用2,2-二苯基-1-苦基苯肼（DPPH）自由基清除能力評價各餾分的抗氧化能力。結果當歸揮發油經分子蒸餾后得到6個餾分。GC-MS結果顯示藁本內酯是各餾分的主要成分。PCA結果顯示各餾分除了在Z-藁本內酯上的差異外，餾分6中的油酸和餾分5中的Z-氧代環十七碳-8-烯-2-酮與其他餾分有較大差異。抗氧化能力測定結果顯示各餾分都有抗氧化能力但有差異，而且對餾分中藁本內酯的含量無依賴性，餾分6和餾分5的抗氧化能力較強，可能與其所含的特異性成分有關。結論本研究可為當歸和其他中藥揮發油的進一步開發利用提供參考。

關鍵詞：當歸；揮發油；分子蒸餾；氣相色譜-質譜法；抗氧化

當歸為傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels.的干燥根，有補血活血、調經止痛、潤腸通便功效[1]，廣泛應用于臨床。現代藥理研究表明，當歸的有效成分有顯著抗血小板聚集、抗動脈粥樣硬化、神經保護、提高機體免疫力和抗腫瘤等作用。揮發油是當歸的主要有效成分之一，有提高免疫力、消炎鎮痛和抗血小板聚集等作用[2-3]。

超臨界流體萃取法是一種快速、清潔的提取技術，提取過程中所需溫度低，能保持揮發油成分的穩定，是中藥揮發油常用的提取手段之一。分子蒸餾也稱為短程蒸餾，是一種快速、高效、無污染的分離和濃縮技術，該技術被認為是分離和純化天然產物的常用方法，尤適用于高沸點、高黏度且熱敏性物質分離，被廣泛用于中草藥揮發油和其他精油的分離[4-5]。

中藥揮發油成分復雜，來源廣泛，有豐富的藥理活性，如在心腦血管系統、中樞神經系統、呼吸系統、胃腸道系統、抗炎、抗腫瘤等方面均有良好作用，在醫藥方面應用前景廣闊[6]。脂質過氧化與許多疾病有關，如癌癥、心血管疾病等。2,2-二苯基-1-苦基苯肼（DPPH）自由基清除能力在體外抗氧化實驗中廣泛應用于體外評價揮發油抗氧化活性[7-9]。

本研究采用超臨界流體萃法取制備當歸揮發油，使用分子蒸餾設備對所得揮發油進一步分餾，應用氣相色譜-質譜法（GC-MS）對所得餾分的化學組成進行分析，并用主成分分析法（PCA）分析各餾分化學組成的差異性，采用DPPH自由基清除能力評價各餾分的抗氧化能力，為當歸及其他中藥揮發油的進一步開發利用提供依據。

1　儀器與試藥

HA220-50-01超臨界流體萃取儀（江蘇南通華安超臨界萃取有限公司），BSA224S分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司），VLK-70分子蒸餾設備（德國瑞達有限公司），Thermo Finnigan 2000 Trace DSQ氣相色譜-質譜儀（美國Thermo公司），Mutiskan GO多功能酶標儀（美國Thermo公司）。

當歸飲片，購自北京本草方源藥業有限公司，經北京中醫藥大學中藥學院中藥鑒定系劉春生教授鑒定為傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels.的干燥根。將當歸飲片粉碎成粗粉用于進一步的提取。DPPH、二甲基亞砜（DMSO），Sigma-Aldrich公司；色譜級乙酸乙酯，Fisher公司；無水乙醇、無水硫酸鈉，北京化工廠。

2　方法

2.1超臨界流體萃取及分子蒸餾

根據本實驗室前期確定的最佳提取工藝對當歸進行超臨界流體萃取[9]，以CO2為萃取溶劑。提取工作條件如下：工作壓力30 MPa，工作溫度50 ℃，提取時間2 h，CO2流量25 L/h；分離器Ⅰ的工作壓力為8 MPa，溫度50 ℃；分離器Ⅱ的壓力為提取系統尾部的壓力，工作溫度35 ℃。

用分子蒸餾設備對所得揮發油進行分餾，工作條件如下：刮刀轉速300 r/min，分子蒸餾過程真空度為0.35 mbar，滴速為1～2滴/s。通過改變溫度來獲得不同的餾分。將所得餾分保存在-20 ℃冰箱中用于進一步研究。

2.2總提取物與各餾分分析

將各餾分適當稀釋后，用無水硫酸鈉脫水，然后采用GC-MS進行分析。采用安捷倫DB-5 MS柱（0.25 mm×30 m，0.25 μm），進樣口溫度230 ℃；升溫程序：80 ℃以3 ℃/min升溫至167 ℃，保持2.5 min，以2 ℃/min升至202 ℃，以4 ℃/min升至280 ℃，保持15 min；載氣為高純氦氣，流速為1 mL/min，進樣量1 μL，溶劑延遲4 min。離子源溫度230 ℃，電離源為EI，電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；四級桿溫度150 ℃，掃描質量范圍為35～550 amu。

2.3抗氧化能力測定

參考文獻[10-12]方法，并稍作修改，測定DPPH自由基清除能力。精密稱取DPPH粉末0.007 98 g放于1000 mL容量瓶中，加無水乙醇定容，充分搖勻，得到濃度為200 μmol/L的DPPH儲備液。將各餾分用DMSO溶解，分別稀釋成相同的系列濃度梯度：100、80、60、40、20、10、5、1、0.5、0.1 mg/mL。分別取各濃度梯度的樣品10 μL，加入到已盛放有90 μL 0.2 mmol/L DPPH溶液的96孔板中，對照組加入等量的DMSO，空白組用等量無水乙醇代替DPPH溶液。25 ℃避光反應20 min后，于518 nm處測定反應混合物的吸光度，每個樣品平行測定3次，計算DPPH清除率。DPPH清除率（%）＝[1－(As－Aa)÷Ac]× 100%。其中，As、Aa、Ac分別代表樣品組、空白組（用DMSO代替樣品溶液）和對照組（用乙醇代替DPPH溶液）的吸收度。

2.4統計學方法

抗氧化試驗結果采用SPSS20.0統計軟件進行分析，數據用±s表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。用Unscrambler 9.7進行主成分分析。

3　結果

3.1當歸揮發油及分子蒸餾各餾分

本研究用超臨界流體萃取法制得了棕色澄明的當歸揮發油，得率為1.4%，其中當歸揮發油中藁本內酯的相對含量為65.98%。

當歸揮發油進行分子蒸餾后得到6個不同的餾分，在100 ℃下分離得到了餾分1（F1），然后將殘渣進一步分離，在110 ℃時，得到餾分2（F2），并將所得的殘渣按照上述方法進一步分離，在120、130、140、150 ℃分別獲得了餾分3（F3）、餾分4（F4）、餾分5（F5）、餾分6（F6）。從F1到F6的顏色逐漸加深，從淺黃色變化到橙黃色。

3.2所得餾分的氣相色譜-質譜分析

通過與NIST 2.0質譜圖庫提供的標準圖譜進行比較，并查閱相關參考文獻，確定各餾分中的化學成分。

GC-MS分析的6個餾分化學成分及相對含量見表1，采用面積歸一化法確定餾分中各化學成分的相對含量。

表1　當歸揮發油各餾分的化學組成

續表1　

藁本內酯是當歸揮發油中的主要有效成分，GC-MS結果顯示，藁本內酯仍是各餾分中含量最高的成分。各餾分中藁本內酯含量從低到高依次為：F6 （32.77%）＜F5（48.63%）＜F1（62.46%）＜F2 （72.27%）＜F4（75.28%）＜F3（79.97%）。

3.3主成分分析

為進一步研究各餾分中化學成分的差異性，采用Unscrambler軟件中的PCA功能，對6個餾分中的化學成分進行分析，結果見圖1、圖2。

以6個餾分中所含化學成分的含量為變量進行分析，提取了2個主成分，圖1、圖2分別為得分圖和載荷圖，分別表示經過降維后6個餾分所含化學成分在二維空間的分布情況。從圖1可以看出，主成分1解釋了總變異的89%，主成分2解釋了總變異的8%。F1、F2、F3、F4處于第一一主成分軸的右邊，在主主因子1上得分較高高，且F2與與F4化學成分相似性最高；F6處于第二主成分軸的上邊，在主成分2上得分較高。由圖2可知，Z-藁本內酯在主因子1上載荷最大，說明6個餾分Z-藁本內酯的含量差異最大；F6與其他餾餾分差異性較大，第二主成分主要與油酸有關，說明油酸可以作為F6的特征性成分。另外，（Z）-氧代環十七碳-8-烯-2-酮對F5的差異性影響較大，可作為F5的特征性成分。而其他化學成分重疊的較多，說明它們們的相似性較較高。餾分中有特征性成成分的存在，可能會會影響其抗氧氧化能力。

圖1　6個餾分化學成分主成分分析得分圖

圖2　6個餾分化學成分主成分分析載荷圖

3.4各餾分DPPH自由基清除能力

所有餾分均有DPPH自由基清除能力，且具有劑量依賴性，隨著劑量增大而提高，各餾分的DPPH自由基清除率曲線見圖3。用半數有效量（EC50，反應20min后清除50%DPPH自由基所需的樣品濃度）評價各餾分自由基清除能力的強弱，見表2。DPPH自由基清除能力強弱依次為：F6＞F5＞F4＞F1＞F33＞F2。結合各餾分中藁本內酯含量可知，藁本內酯不不是決定各餾分抗氧化能力的唯一因素。

圖3　各餾分DPPH 自由基清除率曲線

表2　各餾分中藁本內酯相對含量及其DPPH自由基清除率的EC50

4　討論

本研究GC-MMS結果顯示示各成分具有有一定的相似似性，主要成分藁本本內酯含量有有明顯差異，隨著蒸餾的的進行，各餾分中藁藁本內酯含量量呈現先增后后減的趨勢。

本研究采用DDPPH自由基基清除能力評評價各餾分的的抗氧化能力。結果果顯示，各餾餾分均有抗氧氧化能力，其其抗氧化能力有劑量量依賴性。結結合各餾分中中藁本內酯的的含量分析，F6藁本內酯含量最低而抗氧化能力最強，相反，F2藁本內酯含量相對較高，其抗氧化能力卻相對較弱，這表明各餾分中藁本內酯的共存成分對餾分的抗氧氧化能力發揮揮了重要的作作用。結合PPCA分析結果，FF6中的油酸、F5中的（ZZ）-氧代環十十七碳-8-烯-2-酮是是各自的特有有成分，且F6和F5的抗抗氧化能力都都較強，，說明各餾分分中與藁本內內酯共存的化化學成分可能能起到了了協同抗氧化化作用。因此此，本研究可可為當歸及其其他中草草藥揮發油的進一步研究開發和利用提供有價價值的資資料。

[1] 國家家藥典委員會.中中華人民共和國藥藥典：一部[M].北京：中國醫藥科科技出版版社,2010：124--125.

[2] 劉醫輝,楊世英,馬偉林,等.當歸藥藥理作用的研究進展[J].中國當代代醫藥,,2014,21(22)：1192-193,196.

[3] 李曦,張麗宏,王曉曉,等.當歸化學學成分及藥理作用研究進展[J].中中藥材,,2013,36(6)：10023-1028.

[4] 李燕燕,劉軍海.分子蒸餾技術在天然然產物分離純化中應用進展[J].糧糧食與油油脂,2011(3)：77-11.

[5] 徐浩浩鋒,楊華俊,俞嵐嵐.中藥有效成分分現代提取技術研究進展[J].海峽峽藥學,,2012,24(1)：133-18.

[6] 黃羅羅生,顧燕飛,李紅紅.中藥揮發油及及芳香性藥物的研究進展[J].中國國中藥雜雜志,2009,34(122)：1605-1611.

[7] AROORA N, PANDEY-RRAI S. GC-MS anaalysis of the essential oil of Celasstrus paniculaatus Willd. seeeds and antioxidant, anti--inflaammatory study oof its various soolvent extracts[J]. Industriall Cropss and Products,2014,61：345-351.

[8] 趙晨晨,李蓉,鄒國林..桂丁、花椒揮發發油抗氧化活性及及其方法研究[J].武漢大大學學報(理學版版),2008,54(4)：447-450.

[9] 趙晨.植物揮發油抗氧化活性的研究[J].中國調味品,2008,33(11)：40-43.

[10] 姜玉蘭,樸惠善,李鎬.桑葉抗氧化活性成分的研究[J].中藥材, 2008,31(4)：519-522.

[11] 陳智坤,梁呈元,李維林,等.薄荷不同溶劑提取物抗氧化活性的研究[J].食品工業科技,2013,34(3)：100-103.

[12] 付曉丹,湯春豐,劉壤蓮,等.枇杷葉黃酮提取物的抗氧化作用研究[J].食品工業科技,2015,30(1)：135-139.

（修回日期：2015-06-24；編輯：陳靜）

GC-MS Analysis and Antioxidant Activity Study of Distillates Separated from Essential Oil

of Angelicae Sinensis Radix by Molecular Distillation ZHANG Qing, RU Qing-guo, LIN Hong-mei, LI Hui, LIU Yan, WU Qing (Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

Abstract:Objective To study composition and antioxidant capacity of distillates separated from the essential oil of Angelicae Sinensis Radix by molecular distillation. Methods The distillates of the essential oil of Angelicae Sinensis Radix were obtained by molecular distillation equipment, and the composition of distillates was analyzed by GC-MS. The principal component analysis (PCA) was used to analyze the difference of the composition of each fraction. The DPPH free radical scavenging ability was applied to evaluate the antioxidant capacity of distillates. Results Six fractions were obtained by molecular distillation from the essential oil of Angelicae Sinensis Radix. GC-MS results showed that ligustilide was the main component in each fraction; PCA results showed that oleic acid in fraction 6 and Z-Oxacycloheptadec-8-en-2-one in infraction 5 were different from the other fractions; The antioxidant capacity results showed each fraction had antioxidant capacity, but they were different, and the capacity of antioxidant were uncorrelated with the content of ligustilide in distillates; antioxidant ability of fraction 6 and fraction 5 was strong, which may be related to specific components. Conclusion This study provided reference for further development of the volatile oil in Angelicae Sinensis Radix and other herbal medicine.

Key words:Angelicae Sinensis Radix; essential oil; molecular distillation; GC-MS; antioxidant

收稿日期：（2015-06-11）

通訊作者：吳清，E-mail：qwu@vip.sina.com

基金項目：國家自然科學基金(81073059)

中圖分類號：R284.1

文獻標識碼：A

文章編號：1005-5304(2016)02-0082-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.023