動物轉基因研究中鋅指核酸酶的應用及進展

王嘉彬

華中農業大學

動物轉基因研究中鋅指核酸酶的應用及進展

王嘉彬

華中農業大學

作為一種比較先進的基因修飾技術，鋅指核酸酶技術已經在多種生物轉基因研究領域得到了應用，包括植物、昆蟲、各類動物乃至人類細胞中，強化了人們對于動物復雜生理系統的理解和認知，不僅使得鋅指核酸酶技術成為構造轉基因生物的強力工具，更使得其在許多疾病的治療中發揮出了重要作用。本文主要對鋅指核酸酶在動物轉基因研究中的應用及進展進行了討論。

動物轉基因；鋅指核酸酶；應用；進展

前言

轉基因在當前的科學研究領域雖然并非新的課題，但是其受矚目的程度有增無減，主要是從特定生物體的基因組內提取所需的目的基因，或者人工合成指定序列的DNA片段，將其轉入到生物體中，與生物體的基因組重組后，結合人工選育，獲得具有穩定表現特定的遺傳性狀的個體，在新品種的培育方面意義重大。不過，常規意義上的轉基因一般是指植物，如水稻、玉米等，對于動物轉基因的研究尚屬于一個比較新穎的領域。

1　鋅指核酸酶概述

鋅指核酸酶（Zinc Finger Nuclease）屬于一種人工合成酶，其化學本質為蛋白質。鋅指核酸酶是一個由DNA識別結構域以及非特異性核酸內切酶的剪切結構域融合而成的物質，其N末端為鋅指蛋白DNA結構域，包括了一系列的鋅指蛋白，每一個鋅指蛋白都能夠對一個特意的三聯體堿基進行識別和結合；C末端為非特異性核酸酶剪切結構域。相比較同源重組的DNA序列，鋅指核酸酶具有更強的穩定性，而且其內部鋅指結構和DNA強親和性的特點，使得鋅指核酸酶有著非常突出的特異性作用。

鋅指核酸酶技術憑借自身能夠特異性識別并切割DNA序列的特點，以及良好的可設計性，被用于基因的定點突變和外源基因的定點整合，是最近幾年發展起來的一種基因修飾技術。鋅指核酸酶技術能夠將一個非特異性的核算內切酶與含有鋅指的結構域結合在一起，實現對于特定序列的切割。理論上，可以利用這種技術對染色體特定片段的刪除，完成突變體的構造或者疾病的治療［1］。

在不斷的研究過程中，鋅指核酸酶已經被成功應用于動植物的轉基因研究中，就實際效果而言，具有極高的基因整合效率。而在相關研究實驗中，對特異性的鋅指蛋白（ZFP）進行設計，是最為核心的內容。在針對ZFP識別結構域進行設計時，存在兩種不同的思路，一是寡聚體庫工程法，其所構建的鋅指核酸酶與靶DNA具有較高的親和性及特異性；二是模塊組裝法，即將能夠識別三個連續堿基的鋅指看作模塊，參照目標序列，將不同的模塊拼接在一起。

2　鋅指核酸酶在動物轉基因研究中的應用及進展

經過了大量的研究和試驗，鋅指核酸酶技術在動物轉基因的研究中得到了成功應用，取得了相當顯著的進展，其主要體現在以下兩個方面：

2.1基因定點敲除

在傳統轉基因研究中，采用的基因打靶技術雖然比較可靠，但是效率非常低下，在很大程度上阻礙了研究的進展，而鋅指核酸酶技術（下文統稱ZFN）的出現，為動物轉基因的研究提供了一種相當可靠的技術手段。

早在2001年，Bibikova等人就利用ZFN的特異識別性能，構建了一個靶基因質粒載體，這種載體與表達ZFN的質粒共同注入到卵母細胞中，發現ZFN能夠切開靶基因，并利用同源重組對切口進行修復。在這個研究的基礎上，他們又利用ZFN技術，敲除了X染色體上存在的yellow基因，同時發現這種變異可以非常穩定的遺傳給后代。上述研究結果使得ZFN技術在動物轉基因的研究中的應用成為了可能。

Meng等人在相關研究中，針對斑馬魚血管內皮細胞的生長因子受體基因，設計出了一種ZFN mRAN，將其注入到細胞期的斑馬魚胚胎中，能夠帶來極大的突變效率，雖然同樣存在有脫靶現象，但是相關的研究實驗也從正面表明了可以通過注入mRNA的方式，實現基因打靶［2］。

利用專業打靶GGTA1基因，對半乳糖苷酶轉移酶的催化區域中的ZFN進行編碼，可以得到相應的突變個體，產生GGTA1基因敲除的母體，而通過將ZFN電轉染入雄體胚胎成纖維細胞的方式，同樣能夠實現基因打靶，打靶效率在5.7%，產生GGTA1基因敲除的雄體，表明ZFN在雌雄細胞中都能夠起到相應的基因敲除作用，從而為人類基因相關疾病的治療提供了一個良好的模型。

2.2基因定點重組

上述研究均表明，ZFN技術的應用，能夠非常顯著的提升基因靶向敲除的效率，而事實上，其在動物轉基因中取得的進展不止于此。最近的一些研究項目表明，ZFN技術在提高同源重組效率，實現基因定點重組方面同樣有著巨大的作用。

Porteus等人將預先構建好的ZFN特異識別序列插入到GFP基因中，然后將其整合到了HEK293細胞中，形成了具備突變型GFP的HEK293穩定細胞系，并利用連接在CMV啟動子上的ZFN表達質粒以及表達野生型GFP同源供體質粒，對穩定細胞系進行轉染。結果顯示，部分細胞中存在的突變GFP得到了修復，這也表明了ZFN技術可以在哺乳動物體細胞中實現基因打靶。另外，2010年，Melanie等針對小鼠Rosa26基因，設計構筑了一對ZFN，將潮霉素基因同源打靶載體、Venus同源打靶載體以及β-半乳糖苷酶分別與ZFN一起注射到了小鼠原核胚胎中，產生了轉基因小鼠，經分析鑒定，同源打靶效率在1.7%-4.5%左右［3］。

3　結語

總而言之，大量的研究實驗表明，鋅指核酸酶技術在動物轉基因研究中得到了成功應用，取得了相當的成果，能夠在細胞水平或個體水平上，進行相應的基因敲除和基因重組操作，從而為沒有獲得ES細胞的轉基因動物提供了一種基因操作的可能性。雖然從目前來看，鋅指核酸酶技術在實際應用層面尚存在一些不足，但是相信經過不斷的研究和探索，相關技術必然會愈發完善。

［1］劉曉，方永志，劉文浩，等.鋅指核酸酶技術在動物轉基因研究中的應用［J］.山東農業科學，2013，45（2）：135-138.

［2］王劉豪，王吉田，余昊，王運兵.鋅指核酸酶技術在動物轉基因中的應用［J］.湖北農業科學，2012，51（9）：4177-4180.

［3］袁玉國，彭秋玲.鋅指核酸酶技術在動物轉基因中的研究進展［J］.中國畜牧獸醫，2014，41（8）：188-192.

王嘉彬（1995-），湖北鐘祥人，在讀學校：華中農業大學，專業：動物科學。