不同IBD 滅活疫苗在1 日齡SPF 雞上的免疫效果評價

晉春霞，肖亞朋，習向鋒，楊沛沛，孫哲，王杰，王迎迎，趙坤坤，劉守川

（洛陽中科基因檢測診斷中心有限公司，河南洛陽 471003）

雞傳染性法氏囊病（infectious bursal disease，IBD）又稱甘布羅病，是由雞傳染性法氏囊病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）引起的一種急性、高度接觸傳染性疾病[1]。鄺榮祿于1979 年在廣州首先發現我國存在該病，此后北京、上海、廣東等地也發現了該病[2，3]。由于該病發病突然、病程短、死亡率高，且可引起雞體免疫抑制，目前仍然是養雞業的主要傳染病之一。1987 年比利時北部和荷蘭南部均發現IBDV 超強毒株，我國于1990年后也有報道分離到超強毒株與變異株，給養禽業造成了一定的經濟損失[4]，同時給本病的防控也帶來了難度。

疫苗免疫仍是目前最常用且最有效的手段之一，國內本病的商業化疫苗眾多。常用的有活苗和滅活苗兩大類，活苗有全病毒弱毒疫苗（包括抗原抗體復合物疫苗）和基因工程亞單位活載體疫苗；滅活苗有全病毒滅活疫苗和基因工程亞單位疫苗。滅活苗包括單苗和聯苗，主要以聯苗使用為主。市場上有多家商品化死苗，但質量孰優孰劣難以主觀評判。本試驗選用四種商品化IBD 死苗進行免疫效果評價，現將研究報告如下。

1 材料與方法

1.1 疫苗

4 種商品化疫苗，分別標記為A～D，其中A 為IBD 亞單位滅活聯苗，B～D 為全病毒滅活聯苗，均購自市場。

1.2 攻毒毒株

IBDV BC6/85 株，購自中國獸醫藥品監察所。

1.3 實驗動物

1 日齡SPF 雞，由購自山東斯帕法斯公司的SPF 種蛋自行孵化而來。

1.4 檢測試劑

IBD 標準瓊擴抗原，批號201603，標準陽性血清，批號201701，購自中國獸醫藥品監察所；IBD ELISA 抗體檢測試劑盒，批號LN448，購自IDEXX 公司。

1.5 方法

1.5.1 試驗設計

用54 只1 日齡SPF 雞，分6 組，A-E 組每組10只，F 組4 只（見表1）。A～D 組分別頸部皮下接種疫苗，0.2mL/只，E 組、F 組不免疫。免疫后14、21、28 日，分別翅下靜脈采血，分離血清，測定IBD 的瓊擴抗體、ELISA 抗體。免疫后30 日，除F 組外，各組試驗雞用IBDV 標準強毒BC6/85 株點眼攻毒0.1mL（含100BID），各組隔離飼養。每日觀察并記錄各組試驗雞發病和死亡情況，至攻毒后96 小時剖殺所有試驗雞，觀察法氏囊病變。法氏囊病變的判定標準：法氏囊出現腫大、萎縮、出血、發黃、內有膠凍樣分泌物等一種以上病變。

表1：試驗分組情況

1.5.2 IBD 瓊擴抗體測定方法

稱取瓊脂糖1g，氯化鈉8g，倒入100mL 蒸餾水中混勻加熱溶解后，將其倒入90mm 潔凈玻璃平皿中，每個平皿20mL，靜置冷卻凝固后即為瓊脂平板；用梅花打孔器在所制備的瓊脂平板上打孔，中心與外周孔徑均為3mm，中心孔與外周孔間距也為3mm，封底后進行加樣；中間空加入 IBD 標準瓊擴抗原，外周孔分別加入陰性對照、不同倍數稀釋的陽性血清、不同倍數稀釋的被檢血清；標記清楚倒置于濕盒中37℃孵育72h 判定結果。陰陽性對照成立的條件下，被檢血清與抗原產生沉淀線的最高稀釋度即為該血清的AGP 效價。

1.5.3 IBD ELISA 抗體測定方法

按廠家說明書進行。簡要步驟如下：試劑回溫后進行稀釋樣品、加樣，加樣布局標記清楚，加好樣品的反應板放18～26℃孵育30min，洗板后加入酶標抗體，18～26℃孵育30min，再次進行洗板后加入底物，18～26℃避光靜置15min 孵育顯色，加入終止液在酶標儀讀數后進行計算。

2 結果

2.1 抗體檢測結果

免后14 日僅D 組可檢測到IBDV ELISA 抗體，抗體陽性率為80%，其余組抗體均為陰性；免后21 日A-D組均檢測到抗體，但僅C 組和D 組抗體陽性率在80%以上；免后28 日抗體陽性率與21 日情況相同（見圖1）。從ELISA 抗體平均效價（GMT）可看到，無論是免后21日還是28 日，D 組最高，C 組次之（見圖2）。

AGP 抗體與ELISA 抗體產生情況基本一致。免后14 日A～D 組均可檢測到IBDV AGP 抗體，但陽性率均在30%以下；至免疫后21、28 日，僅C 組和D 組抗體陽性率在80%以上（見圖3）。從AGP 抗體平均效價（GMT）看，免后14～28 日，各組抗體呈逐步上升趨勢，但以D 組抗體水平最高，其次是C 組（見圖4）。

2.2 攻毒保護結果

免后30 日攻毒，攻毒后96h 剖殺，觀察法氏囊病變。結果空白對照組試驗雞均未見任何臨床表現，法氏囊正常（見圖5A）；攻毒對照組試驗雞100%發病，出現精神沉郁、羽毛蓬松等臨床表現，剖檢后法氏囊均有明顯病理變化（見圖5B），取法氏囊用固定液固定后進行免疫組化試驗均為法氏囊抗原陽性（見圖6A、圖6B）；免疫組呈現不同程度的保護率，其中C、D 組100%保護，A、B 組分別60%、80%保護（見圖7）。

圖1：免后不同時間各組ELISA 抗體陽性率

圖2：免后不同時間各組ELISA 抗體平均水平（GMT）

圖3：免后不同時間各組AGP 抗體陽性率

圖4：免后不同時間各組AGP 抗體平均水平（GMT）

圖5：試驗雞法氏囊病理變化

圖6：試驗雞法氏囊免疫組化檢測

圖7：不同IBD 疫苗免疫組攻毒保護率

3 討論

3.1 四種IBD 滅活苗免疫1 日齡SPF 雞，無論是ELISA 抗體、AGP 抗體還是攻毒保護，都呈現出一致的差異：D 苗最好，C 苗次之，A 苗、B 苗較差。這為選擇疫苗提供了一定的參考依據。各疫苗存在的這種差異，可能與疫苗中IBDV 抗原的含量不同相關，也可能與疫苗保存運輸的過程相關。

3.2 IBD 疫苗所產生的ELISA 抗體水平還是AGP 抗體水平，都與IBDV 攻毒保護呈現正相關，這與文獻所報道的IBD 疫苗所產生的AGP 效價與攻毒保護呈正相關的結論是一致的[5]。因此，采用ELISA 和AGP 方法都可以很好的評價IBD 滅活疫苗的免疫效果。