發光細菌在水產品安全中的應用研究進展

段效輝，王　穎，曹　鵬，李金慶，魯　閩，劉　寧

(煙臺出入境檢驗檢疫局，山東 煙臺 264000)

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發光細菌在水產品安全中的應用研究進展

段效輝，王穎，曹鵬，李金慶，魯閩，劉寧

(煙臺出入境檢驗檢疫局，山東 煙臺 264000)

簡單介紹了發光細菌檢測有害物質的機理及用于有害物質檢測的發光細菌種類，綜述了發光細菌在水產品安全中的應用研究進展，包括發光細菌檢測水產品中抗生素、重金屬、甲醛、生物毒素以及急性毒性評價等，并對其應用前景進行了展望。

發光細菌；水產品；有害物質；急性毒性評價

早在17世紀70年代，有研究者發現發光細菌的發光活性可被有害物質抑制[1]。20世紀70年代，研究者們熱衷于從海洋環境中分離獲得發光細菌，用于水質環境有害物質的檢測，這些發光細菌多要求對人體無害且對環境有害物質敏感[2]。此后，發光細菌陸續被用于各種環境污染物質檢(監)測和食品綜合毒性評價，并建立了以發光細菌發光強度變化為指標的有害物質檢測標準，相關的檢測試劑盒也陸續研制成功[3-4]。與化學分析法不同，發光細菌檢測法可作為有害物質的一個初篩步驟， 如果發光細菌法未檢測到有害物質，則不需進行進一步的化學分析。當有多種有害物質同時存在時，發光細菌檢測法還可幫助評估該復合污染物的毒力。為此，作者在此簡單介紹了發光細菌檢測有害物質的機理、用于有害物質檢測的發光細菌種類、發光細菌在水產品有害物質檢測中的應用以及急性毒性評價等，并對發光細菌檢測水產品中有害物質的前景進行了展望。

1　發光細菌檢測有害物質的機理

研究認為，發光細菌的發光是由特異性的熒光酶(LE)、還原性的黃素(FMNH2)、八碳以上長鏈脂肪醛(RCHO)、氧分子等參與的復雜反應[5-7]。發光細菌與有害物質接觸后發光強度會受到抑制，其機理主要分為2種[8]：直接抑制參與發光反應的酶的活性和通過細胞質毒性抑制細胞代謝過程。有害物質可通過單獨一種或兩種機理同時影響發光細菌的發光強度。基于此，一般將發光細菌檢測有害物質或進行急性毒性評價分為直接法和生長法。直接法是將一定濃度的發光細菌直接接種到有害物質溶液中，能立刻檢測發光強度的變化；生長法則是將正常發光強度的發光細菌接種到有害物質溶液中，經過一段時間的生長增殖后檢測發光強度的變化或在整個生長增殖階段監測發光強度的變化。

2　用于有害物質檢測的發光細菌

目前，用于有害物質檢測的發光細菌主要分布于4個屬，這些發光細菌都能夠在正常的生理條件下發射波長在450～490nm之間的可見熒光。發光細菌與有害物質接觸后，其發出的可見熒光強度即發生變化，通過其變化程度，可測定有害物質的濃度或急性毒性[9]。用于有害物質檢測的發光細菌有[10-13]：

(1)弧菌屬(Vibrio)：哈維氏弧菌(V. harveyi)、美麗弧菌生物型(V.splendidusbiotype Ⅰ)、費氏弧菌(V. fischeri)、火神弧菌(V. logei)、東方弧菌(V. orientalis)、青海弧菌(V.qinghaiensis)、霍亂弧菌(V.cholerae)和地中海弧菌(V. mediterratanei)中的某些菌株。

(2)發光桿菌屬(Photobacterium)：明亮發光桿菌(P. phosphoreum)、鰒發光桿菌(P. leiognathi)。

(3)希瓦氏菌屬(Shewanella)： 羽田希瓦氏菌(S. hanedai)。

(4)異短桿菌屬(Xenorhabdus)：發光異短桿菌(X. luminescens)。

以上菌屬多數來自于海洋環境，僅較少量的發光細菌(如發光異短桿菌、青海弧菌、霍亂弧菌)屬于淡水發光菌。由于特定的來源和發光特性，發光細菌在水產品及海水環境有害物質的監(檢)測中應用日益廣泛。

3　發光細菌在水產品安全中的應用

隨著水產養殖規模的不斷擴大，魚類疫病不可避免。養殖水域由于漁藥的任意使用，環境污染日益嚴重，對水產品質量的影響也越來越大。在水產品加工、儲藏過程中，為了保障水產品衛生水平，一些保鮮劑、消毒劑的不規范使用也可能導致有害物質殘留。由于發光細菌對有害物質的生物毒性的高度敏感和易于監測，研究者利用發光細菌建立了水產養殖和水產品加工中常見有害物質(如抗生素、重金屬、甲醛、生物毒素等)的檢測體系和急性毒性評價方法[14]。

3.1檢測水產品中有害物質

3.1.1檢測抗生素

抗生素是水產養殖中濫用情況最嚴重的一類化合物[15]。發光細菌在以氯霉素、四環素為代表的抗生素檢測中得到了較好的應用。朱蘭蘭等[16-17]、王亞群等[18]篩選到適合于水產品中氯霉素檢測的發光細菌，并建立了水產品中氯霉素的發光細菌檢測體系，該檢測體系是基于發光細菌的敏感狀態及與氯霉素作用時間建立的，具有靈敏度高、檢測限低的優點，且成本低、操作簡單快速，擺脫了大型儀器的限制。朱金國等[19]以明亮發光桿菌為指示物，研究了鹽酸金霉素、土霉素等四環素族抗生素對明亮發光桿菌T3變種的發光抑制效應，建立了相關的線性方程，靈敏度比傳統杯碟法高5倍，具有快速、簡便的特點，可快速、靈敏地檢測食品中殘留抗生素。

3.1.2檢測重金屬

眾所周知，水生生物具有較強的富集重金屬的能力，水產品重金屬污染已成為消費者關注的焦點[20]。Thomulka等[8]研究了發光細菌檢測水中重金屬的可行性，并對直接法和生長法的有效性進行評估比較。結果發現，2種方法都可用于水中重金屬檢測，且都比傳統的微生物毒性檢測方法敏感，其中，生長法對有害物質的敏感度更高，能更準確地檢測有害物質。

3.1.3檢測甲醛及生物毒素

束琴霞等[21]利用青海弧菌Q67建立了一種快速檢測水產品中甲醛的方法，可在5 min內檢測甲醛毒性，為水產品中殘留的甲醛現場檢測、監管提供了可靠的技術保障。

真菌毒素、細菌毒素是食品中常見生物毒素，采用發光細菌檢測水產品中生物毒素殘留是發光細菌研究的新方向。劉彩琴等[22]以從深海環境分離得到的發光細菌檢測4種真菌毒素，發現發光細菌對黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A敏感度低，但對玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測效果良好[22]。

3.2急性毒性評價

近年來，以發光細菌進行急性毒性評價的研究得到了較快發展，尤其是在環境保護及其處理效果評估等方面得到很好的應用。Girotti等[23]在對被烴類化合物污染的水和土壤進行生物修復后，利用3株海洋發光細菌監測了污染水和土壤的生物毒性變化過程，同時利用氣相色譜對污染水和土壤中的烴濃度進行檢測，從而證明了發光細菌的急性毒性評價方法的可行性。這一研究給水產品加工措施提供了急性毒性評價手段。

3.2.1對水產品中有害物質的急性毒性評價

若多種有害物質均對發光細菌具有抑制作用，則毒性作用可表現為疊加效應。另外，當外界有害物質濃度發生變化時，其對發光細菌急性毒性也隨之發生變化，從而導致發光細菌發光強度的變化。因此，對環境或樣品的毒性進行監測或評價也是發光細菌在水產品安全方面的重要應用。

馬靜等[24]同時研究了幾種抗生素和重金屬對發光細菌的聯合毒性效應。結果發現，幾種有害物質兩兩聯合對發光細菌均顯示出毒性疊加作用，且具有劑量效應關系。該急性毒性分析方法較傳統的動物實驗(小鼠法、大鼠法)靈敏度高、耗時短，可滿足水產養殖預警及污染突發事件應急分析方面的需求，是利用發光細菌評價急性毒性的重要應用。石穎等[25]以淡水發光細菌青海弧菌Q67為發光指示菌，分析評價了呋喃唑酮、左氧氟沙星等8種獸藥對發光細菌的作用規律及急性毒性效應，也是利用發光細菌對有害物質進行急性毒性評價的有意義的嘗試。吳淑杭等[26]研究了汞、鉻、鎘等3種重金屬對海水發光細菌明亮發光桿菌的單因子毒性效應和二元重金屬混合物的聯合毒性效應，揭示了2種重金屬共存時生物毒性疊加以及毒性效應的主因子作用。

3.2.2對水產養殖表層沉積物和海洋沉積物的綜合毒性監測

水產養殖表層沉積物由飼料、飼用抗生素、動物排泄物、寄生生物、微生物分泌物等多種成分組成，是影響養殖環境安全的重要因素。對表層沉積物的綜合毒性進行評價和監測可有效保障水產養殖水域環境安全。許道艷等[27]利用發光細菌監測海洋沉積物綜合毒性獲得了滿意的效果，為水產養殖、海洋環境監測等提供了便捷有效的技術保障。

4　發光細菌檢測法存在的問題

發光細菌檢測法所具有的方便、快速、低成本等優點使其在水產養殖環境監測、水產品有害物質檢測及急性毒性評價等方面備受重視，尤其在水產品質量的現場檢測監管以及環境監測方面有著廣闊的應用前景。但該法亦存在不足：

(1)特異性不強。首先，由于發光細菌對上千種毒性物質反應靈敏[28]，屬于廣譜性抑制，因此利用發光細菌檢測有害物質的特異性不強。對此，可以從兩方面提高該方法的特異性：一是改進樣品前處理方法，通過優化其提取條件，提高樣品前處理的回收率和提純率[17]；二是從發光細菌自身基因水平出發，采用現代基因工程技術，提高發光細菌對有害物質的響應特異性。Trang等[29]利用基因工程技術構建了重組發光細菌E.coliDH 5α(pJAMA-arsR)，該發光細菌能夠在砷誘導下發出特異性熒光，大大提高其檢測特異性。

(2)重現性不佳。由于細胞發光強度差異較大，利用發光細菌進行現場檢測時需要使用新鮮培養物，以確保細胞活性。細胞復蘇過程會影響細胞活性，如何以合適的細胞活性保存技術保障細胞發光活性的穩定性仍需要進一步研究。目前，細胞活性保存的最佳方法是冷凍干燥法[30-31]。冷凍干燥過程中的保護劑選擇、冷凍干燥條件的選擇和優化是重點研究內容。

5　結語

水產品的安全離不開水產養殖環境監控、水產品加工措施效果評估以及水產品有害物質檢測。針對發光細菌的實際特點，研究者正不斷完善其不足，發揮其技術優勢，使其在水產品安全應用中的適應性更強，一些以發光細菌為基礎的生物傳感器也在不斷研究、建立和改進。隨著現代儀器和光電子技術的發展，發光細菌技術、現代基因工程技術與熒光、紫外等大型分析儀器相結合，將為發光細菌在水產品安全領域的推廣應用提供有力保障。

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Research Progress on Luminescent Bacteria in Safety of Aquatic Products

DUAN Xiao-hui,WANG Ying,CAO Peng,LI Jin-qing,LU Min,LIU Ning

(YantaiEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Yantai264000,China)

Themechanismofpoisonouscomponentsdetectionbyluminescentbacteriaandtypesofluminescentbacteriawereintroduced.Researchprogressonluminescentbacteriainsafetyofaquaticproductswasreviewed,includingthedetectionofantibiotics,heavymetals,formaldehyde,andbiotoxinbyluminescentbacteria,andacutetoxicityevaluation.Andtheapplicationprospectwasforecasted.

luminescentbacterium;aquaticproducts;poisonouscomponent;acutetoxicityevaluation

國家質檢總局科研項目(2015IK200)

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.10.002

Q 939.1X 830.2

A

1672-5425(2016)10-0008-04

段效輝，王穎，曹鵬，等.發光細菌在水產品安全中的應用研究進展[J].化學與生物工程，2016，33(10)：8-11.