重慶地區特異性分枝桿菌噬菌體的分離與裂解肽效能研究

譚剴心鄒俁希

重慶地區特異性分枝桿菌噬菌體的分離與裂解肽效能研究

譚剴心鄒俁希

分離新的分枝桿菌噬菌體，研究其生物學特性，以及裂解酶，將有助于控制分枝桿菌在環境中的傳播，豐富對噬菌體多樣性的認識。噬菌體的裂解性肽段可以與其他化合物分子耦合，成為雙功能分子，如與抗瘧疾的青蒿素結合，可同時殺滅分枝桿菌和瘧原蟲。

實驗方法

噬菌體分離純化。分別取5份土樣10g，加入15ml MP buffer、30μl Amp（50mg/ml）和1ml 新鮮培養的恥垢分枝桿菌懸濁液，混勻。于37℃，160r/min培養過夜。

分別取三份污水樣品300μl，加入新鮮培養的恥垢分枝桿菌宿主菌懸液1mL，LB液體培養基35ml， MP buffer15ml，Amp（50mg/ml）30μl加 CaCl2至終濃度1mmol/L，置37℃，160r/min培養過夜。

取培養過夜樣品12000r/min離心6min，取上清用0.22μm過濾器過濾除菌。將濾液進行倍比稀釋。取1ml恥垢分枝桿菌懸濁液，與3ml濾液混合靜置15min。取2ml宿主菌-噬菌體懸液，再加入4ml水瓊脂（ 0.7%的瓊脂,1mM CaCl2），加入Middlebrook的7H10/ Amp平板上，37℃培養過夜。觀察噬菌斑形成情況。噬菌斑形成時，挑取透明單個噬菌斑接種至宿主菌培養液中進行擴增，經3～5次反復純化后得形狀大小一致的噬菌斑。

噬菌體一步生長曲線。培養200ml恥垢分枝桿菌（含20%Tween80）至OD600達到0.6～0.8。用新鮮7H9

培養基（無Tween80）洗菌體3遍，去除Tween80。在菌液中加入噬菌體，使其MOI達到10。混勻后，37℃溫育30min。13000 r/min離心30s，取上清，用MP buffer重懸，置于37℃搖床，110r/min震蕩培養。從40min起每隔45min取樣50ul，13000 r/min離心30s。取上清，倍比稀釋后用雙層平板法測定噬菌體滴度。重復實驗3次，繪制一步生長曲線。

噬菌體裂解效能實驗。采用平板法測定污水中總菌數。分別取一份污水樣品10ml，13000r/min離心5min，加入噬菌體懸液1ml，混合5min后倍比稀釋8倍，取不同稀釋度的混合液1ml，涂布于7H9固體平板陪養過夜，計算總菌數。做3個平行。

分枝桿菌噬菌體SWU1 lysin基因系統發育樹構建。選取西南大學已完成測序工作的分枝桿菌噬菌體SWU1，學習裂解基因的親緣關系比對方法及構建系統發育樹。登陸NCBI，用Blast軟件將lysin裂解基因序列與GenBank中已有的序列進行比對，用MEGA6構建系統發育樹。

結果與討論

分枝桿菌噬菌體分離。分離到一種噬菌體ZT，噬菌斑的大小。

噬菌體ZT一步生長曲線。將約2×103PFU/mL的噬菌體與約2×102cfu/ mL的宿主菌混合培養，從40min開始取樣，稀釋9個梯度涂板。以時間為橫坐標，以噬菌體滴度為縱坐標作噬菌體ZT的一步生長曲線圖(圖1)，噬菌體ZT感染宿主菌的潛伏期為220 min 左右，爆發時間為180 min 左右，爆發量為4.5×103（噬菌體終滴度9×103PFU/mL）/（菌液初始濃度2×102cfu/mL）。

分枝桿菌噬菌體ZT裂解效能實驗結果。實驗可看到噬菌體對三個平行污水樣品中的菌體，都有明顯得裂解效果，菌株數目均有大幅減少。

lysin基因系統發育樹分析。在GenBank中選取比對出與分枝桿菌噬菌體Mycobacteriophage SWU1的lysinA 基因序列相似度較高的18種噬菌體基因序列，選取與分支桿菌噬菌體Mycobacteriophage SWU1的lysinB 基因序列相似度較高的20種噬菌體基因序列。從分枝桿菌噬菌體SWU1 Lysin A基因的系統發育樹以及分枝桿菌噬菌體SWU1 Lysin B基因的系統發育樹可看出Mycobacteriophage SWU1 Lysin A基因與Mycobacterium phage Chy4,Mycobacterium phage Chy5的同源性達到了98%，Mycobacteriophage SWU1 Lysin B基因與Mycobacterium phage Chy4的同源性達99%，可以推測Mycobacteriophage SWU1與Mycobacterium phage Chy4有較近的親緣關系。

應用實踐及展望

本項目成功從重慶地區環境污水中分離得到一種分枝桿菌噬菌體，對其生理特性及分枝桿菌的主要裂解基因lysin基因的親緣關系進行了研究，為尋找具有地區特異性的分枝桿菌噬菌體，探究噬菌體之間的親緣關系以及其與宿主菌之間的作用機制提供線索。還可以利用噬菌體的高效裂解性和專一性，治理污水中分枝桿菌造成的環境污染。并將在后續試驗中將噬菌體的裂解性肽段與其他化合物分子耦合，成為雙功能分子，開發噬菌體的綜合效能。

由于實驗的偶然性和時間關系，裂解肽的工作正在進行中。在現有實驗結果基礎上，預期我們的下一階段工作會開創一個嶄新的領域。

（作者單位：西南大學附屬中學校；指導教師： 宋潔）