環糊精及其衍生物對降低鉛和菲的藻類毒性研究*

徐 蘭 李 青 章紹康 王光輝

(東華理工大學水資源與環境工程學院，江西 南昌 330013)

藻類作為水生生態系統的第一營養級，具有非常重要的水環境凈化功能，不僅能去除水環境中的氮、磷等營養物質，還可吸附、吸收污水中的重金屬和有機污染物[1]。當污染物濃度過高或暴露時間過長時，藻細胞會發生皺縮、畸變，嚴重的會出現細胞裂解而死亡，甚至可通過食物鏈影響人體健康。鉛是一種蓄積性重金屬毒物，分布廣泛、毒性持久，可通過食物鏈富集后對生態系統以及人體產生毒害作用[2-3]。多環芳烴(PAHs)是一種持久性有機污染物[4]，其中的菲、芴等先后被美國和中國列為優先控制污染物[5]，具有致癌、致畸和致突變[6-7]作用。目前，國內外關于重金屬或多環芳烴對斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)的影響報道較多[8-11]。但環境中的污染物往往不是單獨以一種類別存在的，而是不同種類的污染物共同作用形成復合污染[12]，如何降低重金屬和有機污染物復合污染對水生生物的毒性研究還相對較少，尚處于探索階段。

環糊精(CD)是一類以α-1，4糖苷鍵結合的環狀低聚糖，呈錐筒狀。由于這類化合物本身無毒[13-14]、生物降解性好[15]、不易被土壤吸附[16]，正在逐漸成為研究的熱點。常見的CD同分異構體有α-CD、β-CD和γ-CD，其中以β-CD應用最為廣泛，對β-CD進行化學修飾，可以得到水溶性更好的CD衍生物。徐蘭等[17]用天冬氨酸與β-CD合成了水溶性極好的天冬氨酸-β-CD(ACD)，其對土壤中鎘等重金屬和芴等有機物都具有很好的去除作用。CD及其衍生物主要通過與環境中的污染物(包括有機污染物和重金屬)形成主客體包結物和配合物達到降低或去除其毒性的作用。WANG等[18-19]關于β-CD及其衍生物的一些研究為解決實際環境問題提供了重要思路。筆者選用重金屬鉛和PAHs菲作為代表性污染物，研究CD及其衍生物加入前后斜生柵藻與重金屬和有機污染物間的相互作用，旨在揭示CD及其衍生物對降低重金屬和有機污染物的藻類毒性作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

材料：斜生柵藻和BG-11培養基配方由中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫提供。

試劑：硫酸鉛、α-CD、β-CD、γ-CD、羥丙基-β-CD(HP-β-CD)、無水甲醇、氫氧化鉀、環氧氯丙烷、天冬氨酸均為分析純，菲的質量分數>97%，ACD根據文獻[20]的方法合成。

儀器：XYH-4A型體視顯微鏡，LHP-250型智能人工氣候培養箱，722型可見分光光度計，VS-1300型無菌操作臺，YXQ-LS-50SII型立式高壓蒸汽滅菌鍋，HC-2068型高速離心機。

1.2 培養條件

所用玻璃器皿和培養液、蒸餾水均經過121 ℃滅菌20 min，斜生柵藻培養液培養量為100 mL，pH為7.1，所有實驗均在智能人工氣候培養箱中進行，培養溫度為(25±1) ℃，光照強度為2 000 lx，光暗比為12 h∶12 h，每天振蕩2～3次并隨機更換裝有斜生柵藻培養液的錐形瓶位置。

1.3 實驗方法

1.3.1 斜生柵藻的培養與吸光度的測定

[21]的方法，收到藻種后，在無菌條件下轉入50 mL三角瓶(含30 mL BG-11培養基)內，封好瓶口，置于智能人工氣候培養箱中培養。每隔24 h用可見分光光度計在650 nm處進行吸光度(A650)的測定，并在體視顯微鏡下進行細胞計數得到藻細胞濃度(N，107個/mL)，從而建立藻細胞濃度和吸光度之間的相關關系(見式(1))，R2=0.992 2，因此可以通過測定A650推算藻細胞濃度。

N=3.808 3A650+0.059 8

(1)

1.3.2 ACD對斜生柵藻生長的影響

在1.2節的培養條件下考察新合成的ACD(100 mg/L)對斜生柵藻的影響，以不加任何CD及其衍生物(α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD和ACD)的斜生柵藻培養液作為空白對照。

1.3.3 ACD對鉛脅迫下斜生柵藻生長的影響

用硫酸鉛配制兩組0、0.01、0.10、1.00、10.00、100.00 mg/L的鉛溶液，將含有ACD(100 mg/L)的斜生柵藻培養液接種到其中一組鉛溶液中，將沒有加入ACD的斜生柵藻培養液接種到另一組鉛溶液中，考察ACD對鉛脅迫下斜生柵藻生長的影響。

1.3.4 ACD對菲脅迫下斜生柵藻生長的影響

由于菲不溶于水，實驗過程中需加入3 mL無水甲醇以增加菲的溶解度，因此單獨考察添加3 mL無水甲醇對斜生柵藻生長的影響，并以添加3 mL蒸餾水的斜生柵藻培養液作為空白，以確定無水甲醇的干擾。

配制兩組0、5、10、20、50、100 μg/L的菲溶液，將含有ACD(100 mg/L)的斜生柵藻培養液接種到其中一組菲溶液中，將沒有加入ACD的斜生柵藻培養液接種到另一組菲溶液中，所有溶液中均添加3 mL無水甲醇，考察ACD對菲脅迫下斜生柵藻生長的影響。

1.3.5 CD及其衍生物對復合污染脅迫下斜生柵藻生長的影響

將含有CD及其衍生物質量濃度為100 mg/L的斜生柵藻培養液接種到含有1.00 mg/L鉛和10 μg/L菲的復合溶液中，將不含CD及其衍生物的斜生柵藻培養液接種到另一份含有1.00 mg/L鉛和10 μg/L菲的復合溶液中，考察CD及其衍生物對鉛和菲復合污染脅迫下斜生柵藻生長的影響。

1.3.6 數據處理

藻細胞的生長速率和抑制率分別根據以下公式計算：

V=ln(Nt/N0)/t

(2)

I=(V0-V)/V0×100%

(3)

式中：V為藻細胞的生長速率，h-1；Nt為t時刻的藻細胞濃度，107個/mL；N0為初始藻細胞濃度，107個/mL；t為培養時間，h；I為藻細胞抑制率，%；V0為不加任何CD及其衍生物的斜生柵藻培養液在1.2節的培養條件下藻細胞的生長速率，h-1。

暴露96 h的半數效應濃度(EC50)根據抑制率和暴露濃度的劑量—效應關系得到。

2 結果與討論

2.1 ACD對斜生柵藻生長的影響

ACD對斜生柵藻生長的影響如圖1所示。由圖1可見，在相同培養時間下，添加100 mg/L ACD后藻細胞濃度明顯大于空白對照，并且隨著培養時間的延長，藻細胞濃度均逐漸增加，表明ACD對斜生柵藻的生長具有促進作用。

圖1 ACD對斜生柵藻生長的影響Fig.1 Effects of ACD on Scenedesmus obliquus

2.2 ACD對鉛脅迫下斜生柵藻生長的影響

鉛對斜生柵藻生長的影響如圖2所示。由圖2可見，在相同培養時間下，鉛質量濃度為0.01 mg/L時藻細胞濃度幾乎都比0 mg/L時高，說明低濃度的鉛促進了藻細胞的生長，這是因為微量的鉛是藻細胞自身生長所需的營養元素[22]。當鉛質量濃度≥0.10 mg/L時，與鉛質量濃度為0 mg/L時相比，斜生柵藻的生長均受到了不同程度的抑制；當鉛質量濃度≥10.00 mg/L時，藻細胞濃度隨培養時間的延長急劇下降，斜生柵藻的生長完全受到抑制，且隨培養時間的延長抑制作用增強：說明高濃度的鉛對斜生柵藻產生了毒性效應。

圖2 鉛對斜生柵藻生長的影響Fig.2 Effect of Pb on Scenedesmus obliquus

ACD對鉛脅迫下斜生柵藻生長的影響如圖3所示。與圖2相比，在相同鉛濃度和相同培養時間條件下，含有100 mg/L ACD的斜生柵藻培養液中藻細胞濃度基本比不含ACD的斜生柵藻培養液高。但從圖3來看，鉛質量濃度為0.01mg/L時藻細胞濃度比0 mg/L時低，這可能是ACD與鉛發生了作用，導致兩者對斜生柵藻生長的促進作用均減弱。

圖3 ACD對不同質量濃度鉛脅迫下斜生柵藻生長的影響Fig.3 Effect of ACD on Scenedesmus obliquus stressed by Pb of different concentrations

由此可見，由于ACD對斜生柵藻具有促生長作用，因此可以在一定程度上降低高濃度鉛對斜生柵藻的毒性效應。

2.3 ACD對菲脅迫下斜生柵藻生長的影響

從圖4可以看出，3 mL無水甲醇對斜生柵藻的生長幾乎沒有影響，從而排除了加入助溶劑對研究菲脅迫下斜生柵藻生長的干擾。

圖4 甲醇對斜生柵藻生長的影響Fig.4 Effect of methanol on Scenedesmus obliquus

菲對斜生柵藻生長的影響如圖5所示。從圖5可以看出，與重金屬鉛對斜生柵藻生長的影響類似，菲質量濃度為5 μg/L時藻細胞濃度比0 μg/L時高，說明低濃度的菲不僅不會抑制斜生柵藻的生長，反而會促進其藻細胞的生長。當菲質量濃度≥10 μg/L時，與菲質量濃度為0 μg/L時相比，斜生柵藻的生長都受到了不同程度的抑制；當菲質量濃度為100 μg/L時，斜生柵藻的生長完全受到抑制：說明高濃度的菲對斜生柵藻產生了毒性效應。金香琴等[23]在研究菲脅迫下美人蕉對斜生柵藻生長的影響時也觀察到這種“低促高抑”的現象。原因可能是斜生柵藻能利用低濃度的菲作為碳源，但隨著菲濃度的升高，菲的毒性效應逐漸顯現，超過了斜生柵藻的承受極限，出現中毒癥狀。

圖5 菲對斜生柵藻生長的影響Fig.5 Effect of phenanthrene on Scenedesmus obliquus

ACD對不同質量濃度菲脅迫下斜生柵藻生長的影響如圖6所示。與圖5相比，在相同菲濃度和相同培養時間條件下，含有100 mg/L ACD的斜生柵藻培養液中藻細胞濃度均比不含ACD的斜生柵藻培養液高，說明ACD分子能夠與有機污染物發生作用，使菲的毒性降低。但從圖6來看，菲質量濃度為5 μg/L時藻細胞濃度基本比0 μg/L時低，這也是因為ACD與菲發生了相互作用，從而導致兩者對斜生柵藻的促進作用均減弱。從ACD的分子結構分析，是因為其內部具有立體空腔結構，能夠以類似于細胞吞噬的方式將有機物包結于腔體內。

圖6 ACD對不同質量濃度菲脅迫下斜生柵藻生長的影響Fig.6 Effect of ACD on Scenedesmus obliquus stressed by phenanthrene of different concentrations

2.4 CD及其衍生物對復合污染脅迫下斜生柵藻生長的影響

在含有1.00 mg/L鉛和10 μg/L菲的復合污染脅迫下，不同CD及其衍生物對斜生柵藻生長的影響如圖7所示。由圖7可知，CD及其衍生物都能降低鉛和菲復合污染對斜生柵藻的毒性效應，但不同的CD及其衍生物對降低鉛和菲復合污染的毒性效應效果不同，表現為ACD>HP-β-CD>β-CD>γ-CD>α-CD。這是因為CD分子對菲的包結作用與CD空腔大小有關，其中β-CD的腔體大小(0.79 nm)與菲分子大小(0.79 nm)最為匹配，結合最為牢固，而γ-CD腔體直徑較大(0.80 nm)，包結的菲有可能漏出，α-CD腔體直徑較小(0.78 nm)，不能完全包結菲分子。CD衍生物由于增加了新的基團，除空腔結構可以包結菲外，還能與重金屬鉛發生配位作用，且ACD中的氨基、羧基對鉛的配位能力比HP-β-CD中的羥基強。

圖7 CD及其衍生物對復合污染脅迫下斜生柵藻生長的影響Fig.7 Effect of CD and its derivatives on Scenedesmus obliquus stressed by combined pollution

2.5 ACD對污染物脅迫下斜生柵藻相關指標的影響

根據劑量—效應關系得到，加入100 mg/L ACD可以使鉛對斜生柵藻96 h的EC50由0.96 mg/L增加到了3.79 mg/L，菲對斜生柵藻96 h的EC50由40 μg/L增加到104 μg/L，進一步證明了ACD可以降低鉛或菲等污染物對斜生柵藻的毒性效應。

從表1來看，100 mg/L ACD可以使鉛對斜生柵藻的藻細胞抑制率由58%下降到29%，菲對斜生柵藻的藻細胞抑制率由13%下降到5%；在鉛和菲的復合污染下，藻細胞抑制率明顯增強，在不含CD及其衍生物和含100 mg/L ACD的情況下藻細胞抑制率分別為88%、57%，說明鉛和菲的復合污染表現出協同作用，ACD也能降低鉛和菲復合污染對斜生柵藻的毒性效應。

表1 ACD對污染物脅迫下斜生柵藻藻細胞抑制率的影響

3 結 論

(1) 鉛和菲對斜生柵藻的生長都表現出“低促高抑”的現象。當鉛質量濃度≥0.10 mg/L或菲質量濃度≥10 μg/L時，斜生柵藻的生長都受到不同程度的抑制。

(2) ACD對斜生柵藻的生長具有促進作用，從而可以降低鉛和菲對斜生柵藻的毒性效應。質量濃度為100 mg/L的ACD可以顯著降低鉛和菲的藻類毒性。

(3) 比較不同CD及其衍生物對降低鉛和菲復合污染的毒性發現，效果優劣表現為ACD>HP-β-CD>β-CD>γ-CD>α-CD。

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