一株產生物表面活性劑耐鹽堿菌株的分離及鑒定*

王 君 范延輝 姚志剛

(濱州學院生命科學系，山東省黃河三角洲野生植物資源開發利用工程技術研究中心，山東 濱州 256603)

生物表面活性劑是微生物或植物在一定條件下培養時，在其代謝過程中分泌出的具有一定表面活性的代謝產物，其種類繁多，包括糖脂、磷脂、脂肪酸、脂肽或中性類脂衍生物等[1-2]。相比化學表面活性劑，生物表面活性劑除了具有降低界面張力和表面張力外，還具有無毒、易降解、用量少及生物兼容性等特點[3]，故其在石油工業的生物降黏、提高原油采收率、修復石油污染土壤等方面得到廣泛應用。此外，還應用于醫藥、化妝品生產、造紙、重金屬去除等諸多領域[4]。

近年來，隨著石油與天然氣資源的開發利用，石油泄露與污染事件時有發生，生物修復是一種有效的手段。大多數石油降解微生物具有產生物表面活性劑的特點，這在石油工業具有非常重要的應用。生物表面活性劑的兩親結構可促使烴類污染物乳化、分散，從而加大微生物與石油污染物的接觸面，促進污染物降解[5]。

本研究從石油污染土壤中分離獲得了一株產生物表面活性劑的菌株BG，經鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)，研究了其產生物表面活性劑的最適溫度、pH和鹽度，并對其活性成分進行了提取和初步鑒定，該菌株在黃河三角洲石油污染鹽漬土壤的生物治理方面有應用前景。

1 材料與方法

1.1 培養基

富集培養基：酵母膏0.1 g，葡萄糖2 g，柴油10 mL，NH4NO33 g，KH2PO40.5 g，水1 000 mL。發酵培養基：葡萄糖5 g，酵母粉1 g，蛋白胨2 g，pH=7，水1 000 mL。

1.2 菌種分離

取0.5 g石油污染鹽漬土土樣接種于100 mL富集培養基中，37 ℃振蕩培養7 d。將富集液進行梯度稀釋，涂布發酵培養基固體平板，37 ℃培養2 d，得到單菌落。取初篩后的菌株在發酵培養基中37 ℃過夜培養，使其進入對數生長期。以1%(體積分數)接種量接種于發酵培養集中，37 ℃、180 r/min下培養48 h，對發酵液表面張力變化情況進行測定[6]。

1.3 菌種鑒定

生理生化特征分析參見文獻[7]。16S rRNA序列分析：以菌株基因組DNA為模板，用16S rRNA通用引物(27F：5’-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’，1541R：5’-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3’)擴增得到近全長的16S rRNA。聚合酶鏈式反應(PCR)產物測序后采用Clustal X2.0對所獲得的16S rRNA序列進行比對分析，得到序列之間的相似值；用MEGA 4.1計算出序列的系統進化距離，采用鄰位相連法構建系統進化樹。

1.4 菌株產生物表面活性劑的特性研究

1.4.1 表面張力和生長值測定

將菌株在發酵培養基中37 ℃、180 r/min下振蕩培養48 h后，使用全自動表面張力儀鉑金環法測定發酵液的表面張力。以7 d為周期，每隔12 h取發酵液測定表面張力；0～36 h每2 h測定發酵液在630 nm下的吸光度(OD630)，36 h后每12 h測定OD630，以表征菌株生長值。

1.4.2 菌株產生物表面活性劑最適溫度測定

將菌株接種至發酵培養基中培養，分別在27、32、37、42、47 ℃下，180 r/min振蕩培養48 h，測定不同發酵液的表面張力和OD630。

1.4.3 菌株產生物表面活性劑的耐堿特性

發酵培養基其他成分不變，調節pH分別為7、8、9、10、11、12、13，將菌株接種至不同pH的發酵培養基中，37 ℃、180 r/min下振蕩培養48 h，測定發酵液的表面張力和OD630。

1.4.4 菌株產生物表面活性劑的耐鹽特性

發酵培養基其他成分不變，按照0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%的質量分數添加NaCl，將菌株接種至不同鹽度的發酵培養基中，37 ℃、180 r/min下振蕩培養48 h，測定發酵液的表面張力和OD630。

1.5 生物表面活性劑分離

采用酸沉法提取發酵液中的生物表面活性劑[8]，具體方法是：將菌株接種于發酵培養基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養48 h，將發酵液在4 ℃條件下，8 000 r/min離心10 min，棄菌體。收集上清液后測定表面張力，然后用1 mol/L HCl將上清液的pH調至2，4 ℃靜置過夜后，8 000 r/min下離心10 min，分離沉淀和上清液，將沉淀重溶于去離子水，測定表面張力，獲得生物表面活性劑。

1.6 生物表面活性劑的定性定量分析

采用硫酸-蒽酮糖顯色法進行生物表面活性劑的糖定性分析；采用茚三酮顯色法進行生物表面活性劑的蛋白質定性分析；采用鉬酸銨-高氯酸法進行生物表面活性劑的脂定性分析。采用二氯甲烷/甲醇法、考馬斯亮藍染色法對其中的脂類和蛋白質組分含量進行分析。

1.7 數據分析

采用GraphPad Prism軟件對數據進行方差分析，并對各指標的相關性進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 高產生物表面活性劑菌種的分離

通過富集培養，從石油污染鹽漬土壤中獲得4株優勢菌，分別命名為菌株BB、BF、BL、BG。對4株菌進行復篩，測得4株菌對發酵液表面張力的降低情況。菌株BB、BL、BF、BG將發酵液的表面張力從對照的51.5 mN/m，分別降低到44.5、48.0、45.2、30.7 mN/m(如圖1所示)，降低幅度分別為13.6%、6.9%、12.2%、40.5%，差異達顯著水平(P<0.05)。菌株BG降表面張力的能力最強，作為后續實驗的研究菌種。

圖1 發酵液的表面張力Fig.1 Surface tension of the fermentation liquid

2.2 菌株BG的分類鑒定

參照文獻[7]對菌株BG進行了初步鑒定，該菌株為革蘭氏陽性菌，桿狀、有芽孢、無鞭毛；在發酵培養基平板上37 ℃培養24 h，菌落呈圓形、白色、邊緣整齊、不透明、表面濕潤(見圖2)。淀粉酶實驗、纖維素降解實驗、硝酸鹽還原、VP實驗均為陽性，甲基紅(MR)實驗為陰性。將16S rRNA測序獲得1 448 bp序列，與GenBank數據庫中的序列進行BLAST比對，菌株BG與貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)的16S rRNA序列相似性為99%，構建的菌株BG和GenBank中親緣關系較近菌屬的系統發育樹如圖3所示。經生理生化鑒定和16S rRNA序列分析，可初步判定菌株BG屬于芽孢桿菌屬。

圖2 菌株BG的菌落照片Fig.2 Colonies of strain BG

圖3 菌株BG和其他相關菌株基于16S rRNA序列的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequence of strain BG and its related strains

2.3 菌株BG產生物表面活性劑的發酵曲線

菌株BG生長與降低表面張力的關系曲線如圖4所示。0～24 h，菌株BG在14 h時OD630到達最高點，隨時間延長，生長進入衰敗期。0～48 h，表面張力隨時間延長而降低，由初始的58.4 mN/m降低到48 h時的25.1 mN/m，差異達到顯著水平(P<0.05)；48～96 h，表面張力隨時間延長而增加，最后穩定在37.6 mN/m。可見，發酵48 h，菌株BG發酵效果達到最佳。菌株BG在24 h內生長情況最佳，隨時間的延長生物表面活性劑開始積累，48 h可將發酵液的表面張力降至最低。

圖4 菌株BG生長與降低表面張力的關系曲線Fig.4 Relation between the growth of strain BG and its ability to reduce the surface tension

2.4 溫度對菌株BG降低發酵液表面張力的影響

溫度對菌株BG降低發酵液表面張力的影響如圖5所示。當溫度分別為27、47 ℃時，菌株BG的OD630分別為0.27、0.25，發酵液的表面張力從對照的51.5 mN/m(見圖1)分別降至42.1、43.5 mN/m，分別降低了18.2%、15.6%，差異不顯著(P>0.05)；當溫度分別為32、37、42 ℃時，菌株BG的OD630分別為0.32、0.34、0.29，發酵液的表面張力分別比對照(見圖1)降低了39.8%、48.3%、30.8%，菌株BG的生長值差異仍不顯著(P>0.05)，但是表面張力降低值差異達顯著水平(P<0.05)。當溫度為37 ℃時，菌株BG產生的生物表面活性劑可將發酵液表面張力降低至26.6 mN/m。溫度過低，菌株BG菌體生長緩慢，轉化底物的效率低；而溫度過高，菌體易于老化，不利于生物表面活性劑的合成。

圖5 溫度對菌株BG降低發酵液表面張力的影響Fig.5 Effect of temperature on reduction of surface tension by strain BG

2.5 菌株BG產生物表面活性劑的耐堿分析

pH對菌株BG降低發酵液表面張力的影響如圖6所示。當pH為7～11，菌株BG降低發酵液表面張力之間、菌株生長值之間的差異均不顯著(P>0.05)；當pH分別為12、13時，菌體生長值之間差異仍不顯著(P>0.05)。pH的增加對于生物表面活性劑的產生與表面張力的變化影響較小，可使發酵液表面張力降到26.4 mN/m左右，當pH大于12時表面張力的降低量變小，但是菌株BG降低表面張力的能力仍比對照分別降低了25.8%、18.4%，差異達到顯著水平(P<0.05)。可以看出，菌株BG在堿性較高的環境中仍可產生物表面活性劑。

圖6 pH對菌株BG降低發酵液表面張力的影響Fig.6 Effect of pH on reduction of surface tension by strain BG

2.6 菌株BG產生物表面活性劑的耐鹽分析

NaCl對菌株BG降低發酵液表面張力的影響如圖7所示。當NaCl為0～6%時，菌株BG的表面張力降低能力較強，表面張力之間和菌體生長值之間的差異均不顯著(P>0.05)；當NaCl大于6%時，菌株BG的生物表面活性劑產生能力和生長受到影響，但差異仍不顯著(P>0.05)。當NaCl為9%時表面張力仍可降低到33.5 mN/m，可以看出菌株BG具有很強的耐鹽產生物表面活性劑的特性。

圖7 NaCl對菌株BG降低發酵液表面張力的影響Fig.7 Effect of NaCl on reduction of surface tension by strain BG

2.7 菌株BG產生的生物表面活性劑的提取及分析

從1 L菌株BG的發酵液中提取得到0.127 g棕褐色粉末。將該物質重溶到蒸餾水中，再次測定其表面張力，表面張力平均值為29.5 mN/m。對該物質進行定性分析，結果表明，該物質含有脂類和蛋白質，不含糖類，是一種脂蛋白類物質。定量分析結果表明，脂類和蛋白質質量分數分別為64.7%、35.3%。

3 討 論

黃河三角洲地區是我國第二大石油基地，擁有豐富的油氣資源，然而在石油開采、運輸和加工過程中，造成了嚴重的污染。另外，該地區的土壤以濱海鹽土為主，土壤含鹽量高，土壤表層鹽分為0.4%(質量分數，下同)～3.0%[9]。2009年，國務院已正式批復《黃河三角洲高效生態經濟區發展規劃》。基于此，黃河三角洲的上升發展成為國家戰略，成為國家區域協調發展的重要部分。隨著發展的需要，該地區的石油污染與治理問題也將引起更多的關注，而對該地區進行石油污染鹽漬土壤的生物修復，需要利用耐鹽微生物[10-11]。

石油烴類化合物在土壤中吸附固定，水溶性低是限制其生物修復速率的關鍵因素。表面活性劑能增大石油烴類物質在水相中的溶解度，提高污染物在土壤中的傳質速率和生物可利用性，進而促進其降解[12-13]。生物表面活性劑與化學表面活性劑相比，除具有表面張力低、乳化性能穩定等共同特性外，還具有低毒、易于生物降解、可在原位合成等諸多優點。以特定的方式加入或利用微生物自身所產生的生物表面活性劑促進烴類物質的生物降解，已成為石油污染土壤生物修復的一個重要研究方向[14-15]。

現已報道的產生物表面活性劑耐鹽菌主要有芽孢桿菌屬、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、紅球菌屬(Rhodococcussp.)等，但這些耐鹽菌主要從油田廢水和油污海水中分離得到，由于土壤環境較復雜，在高鹽環境下修復石油污染土壤的應用潛力很有限。MAKKAR等[16]分離到一株芽孢桿菌，該菌株經96 h培養后，可將發酵液表面張力降至34 mN/m，但是該菌株不具有耐鹽堿特性。吳濤等[17]從石油污染鹽漬土壤中分離得到一株耐鹽的沙雷氏菌，可將發酵液表面張力從56.5 mN/m降低到28.4 mN/m。本研究從黃河三角洲的地域實際出發，自黃河三角洲石油污染鹽漬土壤中分離得到一株芽孢桿菌，該菌株培養48 h能將發酵液的表面張力從初始的58.4 mN/m降至25.1 mN/m，并且具有良好的耐鹽堿特性，該菌株在實際應用中是否具有作用將會成為下一步工作的重點，下一步實驗將把該菌株用于石油污染鹽漬土壤的生物修復現場實驗，為生物修復提供可靠的理論和實踐支持。

4 結 論

(1) 從石油污染鹽漬土壤中分離到一株高效產生物表面活性劑的耐鹽堿菌株BG，結合菌落形態、生理生化實驗和16S rRNA序列分析，確定該菌株為芽孢桿菌屬。

(2) 菌株BG在37 ℃、180 r/min下振蕩培養48 h，可將發酵液的表面張力由初始的58.4 mN/m降低至25.1 mN/m。

(3) 溫度對菌株BG產生物表面活性劑的影響較大，最適溫度是37 ℃，此溫度下菌株BG有良好的耐鹽堿特性，顯著降低發酵液表面張力。

(4) 采用酸沉法提取了菌株BG產生的生物表面活性劑，定性分析表明，該物質是一種脂蛋白類物質，其中脂類和蛋白質質量分數分別為64.7%、35.3%。

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