一株深海反硝化菌的分離鑒定及反硝化特性研究*

馮雅麗 李洪珊 李浩然

(1.北京科技大學土木與環境工程學院，北京 100083；2.中國科學院過程工程研究所生化國家重點實驗室，北京 100080)

一株深海反硝化菌的分離鑒定及反硝化特性研究*

馮雅麗1李洪珊1李浩然2#

(1.北京科技大學土木與環境工程學院，北京 100083；2.中國科學院過程工程研究所生化國家重點實驗室，北京 100080)

從深海沉積物中分離獲得一株具有較高脫氮效率的反硝化菌YL-1，通過形態觀察、生理生化特性及16S rDNA同源性分析，確定該菌株為蒙氏假單胞菌(Pseudomonasmonteilii)。考察了C、N質量比(C/N)、碳源、初始pH、溫度及鹽度對其反硝化作用的影響。結果表明：菌株YL-1反硝化最佳條件為最適碳源為乙酸鈉、C/N不低于6∶1、初始pH為7.0～9.0、溫度為25～35 ℃；該菌株具有較強的反硝化性能，鹽度在100 g/L以內時對其反硝化特性影響不大。

反硝化菌 蒙氏假單胞菌(Pseudomonasmonteilii) 16S rDNA 硝酸鹽氮

隨著工農業生產的高速發展和人們生活水平的不斷提高，生活污水和企業工業廢水直接排入水體，水體質量急劇惡化[1]。對于氮素污染的治理，國內外常見的工程技術有選擇性離子交換法、空氣吹脫法、折點加氯法、磷酸氨鎂沉淀法及生物脫氮法等[2]。其中，生物脫氮以其無污染、脫氮徹底和安全等優點被認為是目前較經濟、有效、可行性高的治理技術[3]。生物反硝化即利用反硝化菌的作用，將硝酸鹽氮(亞硝酸鹽氮)轉化為氣態產物脫除，被認為是較經濟有效的脫氮方式[4-5]。

本研究選用具有特殊生態環境的太平洋海底表面沉積物為菌種分離來源，通過富集、分離等步驟，得到一株具有較強反硝化能力的菌株，對其進行鑒定，并在實驗室條件下研究了該菌株的反硝化特性，旨在為生物脫氮技術的實際應用提供有效菌源和技術方法。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

實驗樣品來自中國大洋生物樣品館保藏的太平洋海底表面沉積物。

1.2 培養基

富集培養基[6]：胰化蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10.0 g/L，pH=7.0，121 ℃滅菌20 min。

分離培養基：在富集培養基中加入15～20 g/L瓊脂。

硝酸鹽培養基：KCl 0.13 g/L、NaH2PO43.31 g/L、Na2HPO410.31 g/L、NaCl 2.9 g/L、KNO30.721 8 g/L。該培養基中硝酸鹽氮為100 mg/L，碳源種類及濃度根據實驗要求進行調整。

1.3 菌株分離及純化

在富集培養基中接種海底表面沉積物，放置30 ℃恒溫箱中培養3～5 d后，用接種環蘸取菌懸液至分離培養基上劃線，30 ℃培養，至平板長出明顯菌落。挑取分離平板上菌株單菌落，獲得分離菌株，多次在分離培養基上劃線，30 ℃培養，至顯微鏡下觀察無其他雜菌即得到純化菌株。將單菌落接種于硝酸鹽培養基，測定其反硝化能力，并選擇反硝化能力強的菌株進行進一步研究。

1.4 菌株鑒定

對菌株進行形態觀察、生理生化特性鑒定以及16S rDNA序列測定。16S rDNA擴增引物分別為：上游引物為27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)；下游引物為1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。

1.5 反硝化條件的優化

將5%(體積分數)的接種量接種于裝有高溫滅菌的硝酸鹽培養基的錐形瓶中，錐形瓶用橡膠塞封口后30 ℃、120 r/min振蕩培養，每隔8 h取樣測定硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮含量。為優化菌株的反硝化條件，共設5組實驗，每組實驗均設3個重復。(1)碳源選擇實驗：分別以乙酸鈉、葡萄糖、酒石酸鉀鈉、淀粉和蛋白胨作為唯一碳源，C、N質量比(C/N)為8∶1，初始pH為7.0，溫度為30 ℃，鹽度(以NaCl調節，下同)為50 g/L；(2)C/N影響實驗：控制C/N分別為2∶1～10∶1，乙酸鈉為碳源，初始pH為7.0，溫度為30 ℃，鹽度為50 g/L；(3)初始pH影響實驗：分別設置初始pH為5.0～9.0，乙酸鈉為碳源，C/N為6∶1，溫度為30 ℃，鹽度為50 g/L；(4)溫度影響實驗：分別設置搖床溫度為20～40 ℃，乙酸鈉為碳源，初始pH為7.0，C/N為6∶1，鹽度為50 g/L；(5)鹽度影響實驗：鹽度分別為50～200 g/L，乙酸鈉為碳源，初始pH為7.0，C/N為6∶1，溫度為30 ℃。

1.6 主要分析方法

硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮濃度測定分別采用紫外分光光度法、N-(1-萘基)-乙二胺光度法[7]。

2 結果和分析

2.1 菌株分離與鑒定

通過初步測定各菌株對硝酸鹽氮的降解情況，篩選出硝酸鹽氮去除率最高的一株作為實驗對象，編號為YL-1。如圖1所示，菌株YL-1在分離培養基上培養48 h后，菌落呈圓形，表面光滑，濕潤黏稠，菌落呈白色。經測定，菌株YL-1為革蘭氏陰性，葡萄糖反應為陽性，能運動，16S rDNA序列結果表明該菌株與蒙氏假單胞菌(Pseudomonasmonteilii)相似性為99%，兩者在種水平上具有同源性。結合菌株形態及生理生化特性[8]，可基本確定菌株YL-1為蒙氏假單胞菌。

圖1 菌株YL-1菌落形態Fig.1 The colony morphology of strain YL-1

2.2 反硝化特性研究

實驗中，亞硝酸鹽氮測試結果均在0.002 5 mg/L以下，可忽略不計，因此不再討論分析。

2.2.1 碳源對菌株YL-1反硝化反應的影響

反硝化過程中硝酸鹽還原的電子供體及細胞生長都需要有機碳源來提供[9]。由圖2可見，40 h時，乙酸鈉為碳源時硝酸鹽氮濃度最低，葡萄糖次之，酒石酸鉀鈉和蛋白胨基本不能被菌株利用參與反硝化反應。有研究表明，乙酸鈉屬于低分子簡單化合物，易被微生物利用，降解過程相對簡單[10]。因此，宜采用乙酸鈉作為菌株YL-1反硝化反應的碳源。

圖2 不同碳源條件對菌株YL-1反硝化特性的影響Fig.2 Effects of carbon sources on strain YL-1 denitrification characteristics

2.2.2 C/N對菌株YL-1反硝化反應的影響

由圖3可以看出，當C/N為2∶1和4∶1時，菌株YL-1對硝酸鹽氮的脫除不理想；當C/N為6∶1及以上時，菌株YL-1對硝酸鹽氮的降解基本保持不變，這是由于隨著C/N升高，充足的碳源可滿足菌體生長和反硝化的能量需求，反硝化活性也處于穩定階段[11]。因此，從節約成本的角度考慮，C/N宜為6∶1。

圖3 不同C/N對菌株YL-1反硝化特性的影響Fig.3 Effects of C/N on strain YL-1 denitrification characteristics

2.2.3 初始pH對菌株YL-1反硝化反應的影響

如圖4所示，初始pH在7.0以上時硝酸鹽氮濃度降解相近，初始pH為6.0時反硝化反應情況不佳，初始pH為5.0時短時間內基本不發生反硝化反應；實驗后階段菌株YL-1對硝酸鹽氮的去除量減少主要是由于碳源不足引起。張苗等[12]對螯臺球菌屬(Chelatococcussp.)的研究表明，pH為7.0～9.0時適于細菌生長，反硝化活性穩定。ZHANG等[13]和HIATT等[14]的研究表明，pH為中性或弱堿性時，細菌生長和反硝化酶活性達到最佳，pH過酸或過堿都會影響細菌生長及反硝化活性。以上結論與本研究結果一致。由此可知，初始pH為7.0～9.0時該菌能發揮最佳的反硝化能力。

2.2.4 溫度對菌株YL-1反硝化反應的影響

由圖5可以看出，當溫度為25～35 ℃時，反硝化反應對硝酸鹽氮的去除量較高；低于25 ℃或高于35 ℃時均會不同程度地抑制菌株YL-1對硝酸鹽氮的降解。這是由于，溫度是影響細菌生長及反硝化酶活性的一個重要因素[15-16]。可見，25～35 ℃為菌株YL-1反硝化反應的最佳溫度范圍。

圖5 溫度對菌株YL-1反硝化特性的影響Fig.5 Effects of temperature on strain YL-1 denitrification characteristics

2.2.5 鹽度對菌株YL-1反硝化反應的影響

由圖6可以看出，菌株YL-1有一定的耐鹽性，當鹽度控制在100 g/L以下時，硝酸鹽氮濃度降解相近；高于100 g/L時隨著鹽度的增大，菌株YL-1對硝酸鹽氮降解的抑制程度增大。由此可見，菌株YL-1分離自深海沉積物，鹽度在100 g/L內時對其反硝化特性影響不大，該菌株可利用的鹽度范圍較廣，適用于不同鹽度水平的自然水體的氮素去除，應用前景廣闊。

圖6 鹽度對菌株YL-1反硝化特性的影響Fig.6 Effects of salinity on strain YL-1 denitrification characteristics

3 結 論

(1) 通過富集、分離及硝酸鹽培養基分離篩選，從深海沉積物中篩得一株脫氮性能較好的菌株YL-1。對菌株進行形態觀察、生理生化特性鑒定及16S rDNA序列測定，可確定菌株YL-1為蒙氏假單胞菌。

(2) 菌株YL-1反硝化最佳條件：最適碳源為乙酸鈉，C/N不低于6∶1，初始pH為7.0～9.0，溫度為25～35 ℃。該菌株具有較強的反硝化性能，鹽度在100 g/L以內時對其反硝化特性影響不大，反硝化的適宜條件范圍較廣。因此，該菌株具有進一步研究及應用的價值。

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Identificationanddenitrificationcharacteristicsofadeepseadenitrifier

FENGYali1，LIHongshan1，LIHaoran2.

(1.CivilandEnvironmentalEngineeringSchool，UniversityofScienceandTechnologyBeijing，Beijing100083；2.StateKeyLaboratoryofBiochemicalEngineering，InstituteofProcessEngineering，ChineseAcademyofScience，Beijing100080)

A denitrifying bacteria YL-1 was isolated from the deep-sea sediments which showed a high nitrogen removal efficiency. YL-1 was finally determined asPseudomonasmonteiliithrough morphological，physiological and biochemical characteristics，and 16S rDNA homology analysis. The effects of carbon source，C/N mass ratio，initial pH value，temperature and salinity on its denitrification characteristics was carried out. The optimum conditions of denitrification for strain YL-1 were as follow: the optimal carbon source was sodium acetate,the ratio of C/N was not less than 6∶1,the initial pH was 7.0-9.0 and the temperature was 25-35 ℃. YL-1 had perfect denitrification performance,the salinity of 100 g/L or less had little effect on its denitrification characteristics.

denitrifiers;Pseudomonasmonteilii; 16S rDNA; nitrate nitrogen

馮雅麗，女，1967年生，博士，教授，主要從事礦物微生物技術方面的研究工作。#

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*國家水體污染控制與治理科技重大專項(No.2015ZX07205-003)；國家自然科學基金資助項目(No.21176026、No.21176242)；中國大洋礦產資源研究計劃(No.DY125-15-T-08)。

10.15985/j.cnki.1001-3865.2016.12.006

編輯:黃 葦 (

2015-07-02)