真核細胞自噬現(xiàn)象及其對骨重塑的作用

劉 勃，尹鵬濱，張立海，陳思斌，全宸良，王 松 綜述 唐佩福 審校

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真核細胞自噬現(xiàn)象及其對骨重塑的作用

劉 勃，尹鵬濱，張立海，陳思斌，全宸良，王 松 綜述 唐佩福 審校

自噬；骨重塑；骨穩(wěn)態(tài)；骨代謝疾病

眾所周知，骨骼為軀體提供支撐和保護，骨功能的發(fā)揮需要骨形態(tài)、骨量、骨質等的長期穩(wěn)定。骨骼是個不斷變化的器官，在整個生命周期中，一直存在骨吸收和骨生成活動。機體通過骨重塑過程達到或維持骨穩(wěn)態(tài)。在成骨細胞、破骨細胞、骨細胞等細胞、激素、相關理化因子的密切配合下，其過程受到精密調控。骨重塑過程障礙會導致骨硬化癥、骨質疏松癥、佩吉特骨病等多種骨病。越來越多的研究表明，自噬參與調控成、破骨及骨細胞生命活動。自噬很可能參與骨重塑過程。筆者將對自噬參與骨重塑過程的研究進展進行綜述。

1 真核細胞自噬現(xiàn)象

自噬是真核細胞生物主要的降解系統(tǒng)之一，細胞通過自噬將胞內(nèi)異常蛋白質、受損和老化的細胞器、病原體等降解，產(chǎn)生氨基酸、核苷酸等供機體進行物質合成、能量代謝等生命活動。自噬具有重要意義：一方面，細胞長期維持低水平的自噬活動，清除生命活動中產(chǎn)生的各種“不良”物質，維持胞內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定；另一方面發(fā)生營養(yǎng)匱乏、缺氧、炎性反應、感染等應激狀況時，胞內(nèi)自噬活動增強，產(chǎn)生更多氨基酸、核苷酸等，細胞藉此對抗應激、維持存活[1]。自噬分為啟動、成核、延伸、融合降解四個階段，每個階段都受到相關蛋白的精密調控。自噬啟動時，ULK1脫磷酸，ULK1-ATG13-ATG101-FIP200復合體活化，激活Ambra1，Beclin-1-Vsp34-Vsp15-ATG14L-Ambra1復合體在成核部位聚集并活化，Ambra1與TRAF6還可活化ULK1-ATG13-ATG101-FIP200復合體，活化的Beclin-1-Vsp34-Vsp15-ATG14L-Ambra1復合體產(chǎn)生PI3P，PI3P募集DFCP1、WIPI等蛋白促進成核(nucleation)；成核部位出現(xiàn)游離雙層膜結構；ATG7、ATG10作用下，ATG12-ATG5-ATG16L復合物形成，ATG7、ATG3作用下，水溶性LC-I結合PE變?yōu)橹苄缘腖C-II；兩者(ATG12-ATG5-ATG16L復合物和LC-II)均結合在新生成的雙層膜結構上，共同促使雙層膜結構不斷延伸，包裹部分胞漿及待分解的底物，形成自噬體；隨后自噬體外膜與溶酶體融合，內(nèi)膜及包裹的底物釋放到溶酶體腔中被降解并循環(huán)利用，包括p62、NBR1、NDP52等多種支架蛋白參與此過程[2]。

2 自噬對骨重塑的作用

骨重塑是一個受到精密調控的過程，多種細胞、大量細胞因子及相關生化因子參與其中。細胞方面，來源于造血干細胞的破骨細胞進行骨吸收。隨后來源于間充質干細胞的成骨細胞合成骨基質，并參與其礦化，生成新骨。成骨細胞包埋在礦化的骨基質中變?yōu)榻K末分化的骨細胞，骨細胞感受骨內(nèi)的應力及激素水平變化，調控成、破骨細胞活動。大量研究表明，自噬相關蛋白參與調控成骨細胞、破骨細胞及骨細胞的生命活動；全基因組關聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，自噬相關基因與身高及骨質疏松癥密切相關。種種跡象表明自噬參與骨重塑及相關疾病的調控過程。

2.1 成骨細胞與自噬 成骨細胞調節(jié)骨形成，骨形成受到精密調控。諸如PTH、TGFβ-1、IGF、BMP等大量激素和細胞因子參與其調控[3]。有研究表明，BMP具有強烈成骨作用，它的拮抗劑NOG可以使急性胰腺炎細胞中LC-II降低，而加入過量BMP2后，這種效應被逆轉，且BECN1、LAMP2水平會升高[4]。間接說明成骨活動可能受到自噬調節(jié)。自噬受體NBR1是一種重要的支架蛋白，它一方面通過LIR結構域與自噬體膜上的LC-II結合，另一方面通過UBA結構域與底物結合，從而使底物結合到自噬體中。Whitehouse等[5]采用基因修飾的方法使NBR1的LIR和UBA結構域缺失，構建了Nbr1tr/tr小鼠模型。Nbr1tr/tr小鼠體內(nèi)自噬水平低，出生9個月時骨量、骨礦物質密度與對照組相比顯著增加。細胞學研究表明，Nbr1tr/tr小鼠成骨細胞MAPK信號通路激活，細胞分化及成骨能力顯著增強[5]。然而有人得出不同結論，Liu等[6]靶向敲除了成骨細胞中誘導自噬發(fā)生的ULK1-ATG13-ATG101-FIP200復合體的重要構成物FIP200，構建了FIP200F/F小鼠模型；出生6個月后小鼠體內(nèi)自噬水平低，骨質及骨量較對照組明顯降低，進一步研究發(fā)現(xiàn)FIP200F/F小鼠成骨細胞的晚期分化能力以及礦化新合成的骨基質的能力降低。與此相一致，Darcy等[7]發(fā)現(xiàn)自噬誘導劑雷帕霉素促進成骨細胞分化。Nollet等[8]發(fā)現(xiàn)敲除ATG7、BECN1的成骨細胞礦化新合成的骨基質的能力降低，并指出自噬體可能是成骨細胞分泌羥基磷灰石的載體。總的看來，自噬是促進還是抑制成骨細胞分化、增殖及礦化成骨仍是一個懸而未決的問題，且涉及的分子機制還需要進行深入研究。

2.2 破骨細胞與自噬 破骨細胞介導骨吸收。來源于造血干細胞的破骨前體細胞，受M-CSF、RANKL刺激后，分化為破骨細胞。破骨細胞吸收骨基質中的有機物和無機物，致使骨基質表面凹凸不平，形成細胞樣的骨陷窩。破骨細胞面向骨陷窩的一側，伸出許多絨毛樣的凸起，構成刷狀緣。破骨細胞通過刷狀緣分泌酸及CTSK、MMP9、MMP13等水解酶來分解骨質[3]。自噬可抑制破骨細胞增殖、分化及功能活化。DeSelm等[9]發(fā)現(xiàn)，敲除破骨細胞前體的ATG5、ATG7，破骨細胞刷狀緣形成障礙，水解酶分泌減少，骨吸收能力下降；而分化情況未受影響。免疫抑制藥雷帕霉素通過阻斷mTOR信號通路促進自噬。Sanchez等[10]發(fā)現(xiàn)給幼年大鼠飼喂雷帕霉素后其脛骨骨骺處破骨細胞數(shù)目減少，自噬水平降低。Smink等[11]發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可通過C/EBPβ-MafB信號通路抑制自噬同時減少破骨細胞生成。但也有研究者認為，自噬促進破骨細胞骨吸收活動。ZHAO等[12]使用自噬抑制藥3-MA處理缺氧環(huán)境下培養(yǎng)的類破骨細胞RAW264.7，發(fā)現(xiàn)其增殖分化能力明顯降低，進一步的研究發(fā)現(xiàn)細胞通過HIF-1a/BNIP3信號通路調控自噬及破骨細胞生成分化。越來越多研究表明，自噬參與破骨細胞增殖、分化及功能活化，細胞自噬活動異常可能導致某些骨疾病的發(fā)生。通過前期研究人們對破骨細胞自噬活動有了一定了解，但是對參與調控的相關分子通路仍然缺乏足夠了解，有待進一步地研究。

2.3 骨細胞與自噬 骨細胞在骨重塑過程中發(fā)揮重要作用：一方面它合成骨硬化蛋白，通過Wnt信號通路抑制成骨細胞成骨[13]；另一方面合成RANKL，通過RANKL/RANK/OPG軸促進破骨細胞破骨[14]。研究表明，骨細胞幫助破骨細胞識別骨重塑的發(fā)生部位，其凋亡崩解后釋放含有RANKL的凋亡小體，促進破骨[15]。骨細胞是終末分化的成骨細胞，成骨細胞包埋在新合成的骨基質中，伸出突起與周圍細胞形成縫隙連接，分化為骨細胞。骨組織內(nèi)缺氧且營養(yǎng)相對匱乏，骨細胞在其中長期生存，存在較高自噬水平。Zahm等[16]發(fā)現(xiàn)小鼠長骨來源的骨樣細胞MLO-A5細胞系在營養(yǎng)匱乏、缺氧等應激條件下自噬水平升高，進而推測自噬是骨細胞在骨組織應激條件下得以長期生存的原因。Onal等[17]發(fā)現(xiàn)，靶向敲除骨細胞Atg7，小鼠自噬水平降低，皮質骨變薄，骨量明顯下降，與衰老時骨骼的表現(xiàn)一致，因此，可以推測動物衰老后骨量減低與骨細胞的較低自噬水平有關。Luo等[15]定期向衰老大鼠腹腔注射自噬誘導劑雷帕霉素，3個月后大鼠骨細胞自噬水平升高，骨量下降速度減緩。目前關于骨細胞自噬的研究相對較少，現(xiàn)有的證據(jù)表明自噬可能延長骨細胞存活時間，防止骨流失。關于自噬如何調控骨細胞功能發(fā)揮還有待進一步闡明。

2.4 骨疾病與自噬 骨質疏松癥是一種以骨量減低、骨顯微結構破壞、骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特點的代謝性骨病。好發(fā)于老年人及絕經(jīng)后婦女，它起病隱匿，患者往往在發(fā)生骨折或是體檢時才發(fā)現(xiàn)患病。致死、致殘率高，給患者及其家庭帶來巨大的身心痛苦和沉重的經(jīng)濟負擔。骨重塑異常被認為是骨質疏松癥的可能病因[18]。目前，人們對調控骨重塑的分子通路仍然缺乏足夠認識。通過研究各種骨細胞的自噬現(xiàn)象及相關分子機制，有助于深入了解骨質疏松癥的病因并找到對應的藥物靶點。骨折是骨的完整性和連續(xù)性遭到破壞。骨折后，骨及周圍組織細胞的穩(wěn)態(tài)被打破，機體發(fā)生一系列生理和病理反應來恢復骨折前的平衡狀態(tài)。以往的研究表明，對抗應激、維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是自噬的基本作用。那么，骨折后機體的自噬水平是否發(fā)生變化？能否通過調控自噬來影響骨折恢復進程呢？對于這些問題一些研究小組已經(jīng)進行了初步的探索。Zhou等[19]發(fā)現(xiàn)骨折局部細胞增殖水平和自噬水平正相關。Ge等[20]發(fā)現(xiàn)，通過腹腔給予骨折大鼠自噬誘導劑雷帕霉素可以使其自噬水平提高、骨痂形成量增多、骨折愈合加速。然而，雷帕霉素不良反應較大，找到傷害小、療效好的自噬調節(jié)劑是未來研究的一個方向。

雖然前期研究取得部分進展，但還有許多問題亟待解決。如，是自噬相關蛋白還是自噬過程本身參與調控骨重塑過程？自噬通過哪些分子通路調控各類骨細胞的增殖、分化及功能活化？自噬過程如何影響各類骨細胞的生存和死亡？研究自噬活動與骨重塑的關系意義重大：一方面可以加深對諸如骨質疏松癥等代謝性骨病病因及骨折愈合過程的了解，發(fā)現(xiàn)代謝性骨病的新治療靶點以及加速骨折愈合的方法；另一方面可以探索新的實驗技術，拓展原有技術的應用范圍。相信隨著研究技術的進步和相關知識的積累，在這方面的研究會取得越來越多的成果。

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(2016-04-05收稿 2016-07-15修回)

(責任編輯 張 楠)

劉 勃，碩士研究生。

100853 北京，解放軍總醫(yī)院骨科

張立海，E-mail:zhanglihai74@qq.com

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