斑玉蕈培養(yǎng)過程中酶活性與菌包成熟度的關系*

張職視，林 輝，王麗芬，陳桂珍，賴淑芳，詹森然，李佳歡，孫淑靜，，胡開輝，**

（1．福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350002；2．福建農林大學 （古田）菌業(yè)研究院，福建 古田 352200）

斑玉蕈培養(yǎng)過程中酶活性與菌包成熟度的關系*

張職視1，林 輝2，王麗芬2，陳桂珍2，賴淑芳1，詹森然1，李佳歡1，孫淑靜1，2，胡開輝1，2**

（1．福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350002；2．福建農林大學 （古田）菌業(yè)研究院，福建 古田 352200）

為建立科學可靠的判斷斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus）菌包成熟度的生物學參數(shù)評價指標，為工廠化生產菌包成熟度的判斷提供科學依據(jù)。分別通過3，5-二硝基水楊酸法、碘試液比色法、福林酚法、2，2-聯(lián)氮-二 (3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽法、愈創(chuàng)木酚法分析斑玉蕈菌包不同培養(yǎng)時間其羧甲基纖維素酶、木聚糖酶、淀粉酶、中性蛋白酶、漆酶和錳過氧化物酶活性變化，以及培養(yǎng)時間與出菇產量之間的關系。結果表明，菌包培養(yǎng)溫度在21℃～25℃，培養(yǎng)時間120 d左右，菌包上、中、下各部木聚糖酶活力趨于13．7 U·mL-1；在70 d菌包上部漆酶活力達到最高值，在100 d中部與下部漆酶活力達到最大值；在120 d各部分漆酶活力趨于173．5 U·L-1，纖維素酶活力達6 U·mL-1～8 U·mL-1，淀粉酶活力保持在20 U·mL-1左右，中性蛋白酶活力4 U·mL-1左右，下部錳過氧化物酶活力達40 U·mL-1時，此階段出菇的產量最高達461．7 g·袋-1。

斑玉蕈；酶活力；生物學效率

斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus） 是近年來福建省工廠化生產的重要品種之一。菌包成熟度是斑玉蕈栽培過程中的關鍵影響因子之一。目前國內外的研究主要集中在其生物學特性[1]、遺傳育種[2-3]、子實體營養(yǎng)物質及生理活性物質[4]、原材料的開發(fā)與栽培特性[5-9]、酶活性和蛋白質組[10-11]等方面，對栽培過程中菌包成熟度的判斷指標缺乏系統(tǒng)研究。由于斑玉蕈是一個低溫結實性品種，在栽培生產中發(fā)菌較為緩慢，后熟培養(yǎng)時間長，生產周期長達120 d～150 d以上[12]。發(fā)菌時間長短取決于菌包成熟度，菌包不夠成熟會導致產量低下甚至不出菇，造成產量不穩(wěn)定，商品價值低；而菌包過于成熟，又造成栽培周期過長，加大企業(yè)的生產成本。目前國內工廠化生產斑玉蕈過程中，對菌包成熟度的判斷主要憑借生產經驗，缺乏有效的判斷依據(jù)，以致工廠化生產出菇不整齊，穩(wěn)定性差。因此，有學者曾經對不同栽培時間的瓶裝斑玉蕈失重和含水量與出菇產量和質量的關系進行了研究[13-14]，但未見利用酶活性進行成熟度判定的相關報道。本研究通過觀察不同培養(yǎng)時間斑玉蕈菌包的生物學參數(shù)，研究培養(yǎng)時間對斑玉蕈現(xiàn)蕾、出菇速度、子實體品質和產量的影響，以期為建立科學地判斷菌包成熟度的方法提供參考，為設定斑玉蕈標準化生產的栽培參數(shù)提供有力的證據(jù)，為工廠化生產中穩(wěn)定產量發(fā)揮指導作用。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

斑玉蕈（閩真2號)，為福建農林大學生命科學學院微生物工程實驗室保藏菌種。

1.2 菌包制作方法

生產菌包配方：棉籽殼48%、木屑10%、甘蔗渣10%、麩皮20%、玉米粉5%、豆粕5%、石灰2%，含水量63%，每袋裝干料500 g，121℃滅菌2 h。

1.3 不同成熟度斑玉蕈菌包出菇及生物學參數(shù)測定

將菌種接入菌包，置于25℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時間分別為60 d、70 d、80 d、90 d、100 d、110 d、120 d、130 d和140 d，每個處理設置8袋，設置3個重復。然后搔菌，出菇，定時觀察菌袋出菇情況，記錄菌絲恢復料面泛白時間、原基形成時間，采收時間、出菇產量以及品質。

出菇管理分4個階段：16℃～19℃，濕度95%～98%，無光照，不通風3 d；13℃～16℃，濕度90%～95%，CO2濃度控制在2 700 μL·L-1，每2 h光照2 min至原基形成，時間約7 d；13℃～16℃，濕度90%～95%，CO2濃度控制在2 400 μL·L-1，無光照，培養(yǎng)至菌柄長2 cm～4 cm，菌蓋2 mm～4 mm，時間約7 d；2℃～15℃，濕度90%～95%，CO2濃度控制在7 000 μL·L-1，無光照，培養(yǎng)至采收，時間約10 d，整個出菇時間約27 d。

1.4 斑玉蕈菌包酶活力測定

1．4．1 酶液提取方法

取每個階段的菌包3袋，每個菌包分為上、中、下三部分，每部分培養(yǎng)料用手充分揉碎混勻，稱取10 g于50 mL燒杯中，加40 mL蒸餾水，25℃，150 r·min-1震蕩2 h，過濾，取濾液于50 mL離心管，9 000 r·min-1離心15 min，上清液即為粗酶液。

1．4．2 羧甲基纖維素酶活力測定

在試管中加入1 mL 1%CMC-Na溶液，再往試管中加入0．5 mL粗酶液，50℃保溫30 min。在試管中加入1．5 mL DNS試劑，再沸水浴7 min，然后用冷流水冷卻終止反應。用蒸餾水定容至10 mL，充分混勻。用滅活酶液作空白對照。在520 nm處測吸光度。酶活力單位的定義為：在50℃、pH4．6的條件下，每分鐘水解底物生成1 μg葡萄糖所需的酶量定義為1個酶活力單位“U”[15]。

1．4．3 木聚糖酶活力測定

吸取1%木聚糖750 μL到試管中，再往試管中加入250 μL粗酶液，50℃保溫30 min。在試管中加入1．5 mL DNS試劑，再沸水浴7 min，然后用冷流水冷卻終止反應。用蒸餾水定容至10 mL，充分混勻。用滅活酶液作空白對照。在550 nm下測吸光度值。酶活力單位的定義為：在50℃、pH5．2的條件下，每分鐘水解底物生成1 μg D-木糖所需的酶量定義為1個酶活力單位“U”[16]。

1．4．4 淀粉酶活力測定

吸取4 mL可溶性淀粉溶液于試管中，置于60℃恒溫水浴中預熱5 min。加入磷酸緩沖液1 mL，再加入粗酶液500 μL，計時反應30 min。立即吸取反應液1 mL，加入盛有0．5 mL稀鹽酸和5 mL稀碘液的試管中，搖勻。用滅活酶液作空白對照。在660 nm處測定吸光度。酶活力單位定義：在 60℃、pH6．0條件下，每分鐘液化1 μg可溶性淀粉，定義為1個淀粉酶活力單位“U”[17]。

1．4．5 蛋白酶活力測定

在2 mL離心管內加入粗酶液0．5 mL，置于40℃水浴中預熱2 min，再加入經同樣預熱的酪蛋白0．5 mL，精確保溫30 min。時間到后，立即再加入0．4 mol·L-1的三氯乙酸1 mL，以終止反應。8 000 r·min-1離心1 min。另取10 mL離心管若干，每管內加入上清液1 mL，再加0．4 mol·L-1碳酸鈉5 mL，福林酚試劑100 μL，搖勻，40℃保溫發(fā)色20 min，以滅活的酶液為對照。于660 nm處測定吸光度。酶活力單位的定義為：在40℃、pH7．2條件下，每分鐘水解酪蛋白產生1 μg·L-1酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位“U”[18]。

1．4．6 漆酶活力測定

準確移取HAc-NaAc緩沖液 (pH4．5)2．7 mL、1 mmol·L-1ABTS溶液0．2 mL，混合，搖勻，在30℃恒溫水浴鍋中水浴預熱5 min。將上述混合試劑倒入容積為3 mL的比色皿中，420 nm處調零。準確加入粗酶液100 μL，立即記錄吸光值，每隔30 s記錄1次，共記錄3 min。酶活力單位的定義為：每分鐘氧化1 μmol底物所需要的酶量為一個酶活單位“U”[11]。1.4.7 錳過氧化物酶活力測定

準確移取4 mmol·L-1愈創(chuàng)木酚 0.7 mL、100 mmol·L-1pH4.5琥珀酸鈉緩沖液2 mL、2.5 mmol·L-1的H2O20.1 mL、5 mmol·L-1的MnSO40.2 mL，混合，搖勻，在40℃恒溫水浴鍋中水浴預熱5 min。將上述混合試劑倒入容積為3 mL的比色皿中，465 nm處調零。加入0.2 mL粗酶液，立即記錄吸光值，每隔30 s記錄1次，共記錄3 min。酶活力單位的定義為：每分鐘氧化1 μmol MnSO4的酶量為一個酶活單位“U”[19]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用DPS軟件LSD多重比較法進行單因素方差分析，用EXCEL軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 斑玉蕈菌包的酶活性

2.1.1 羧甲基纖維素酶活力變化

纖維素酶是一種能分解纖維素的胞外酶，是由多種水解酶組成的復雜酶系，可以一直將纖維素分解到葡萄糖為止，從而為菌絲生長提供能源，是真菌碳代謝過程中的重要酶系。羧甲基纖維素酶活力隨斑玉蕈菌包培養(yǎng)時間變化見圖1。

由圖1可知，斑玉蕈菌包羧甲基纖維素酶活性比較低，在菌包培養(yǎng)的各個階段變化不大，活力基本維持在6 U·mL-1～8 U·mL-1。說明斑玉蕈培養(yǎng)過程中始終存在降解纖維素的過程，也是斑玉蕈生產周期長的原因之一。對羧甲基纖維素酶活力變化的方差分析（見表1）表明，各階段纖維素酶活性間差異不顯著。

圖1 羧甲基纖維素酶活力隨斑玉蕈菌包培養(yǎng)時間的變化Fig.1 Changes in cellulase activity of Hypsizygus marmoreus bag with incubation time

表1 羧甲基纖維素酶活力變化的方差分析Tab.1 Variance analysis on cellulase activities of Hypsizygus marmoreus bag

2.1.2 木聚糖酶活力變化

斑玉蕈在水解木聚糖時產生的酶往往是一個多酶復合體，各種酶相互調節(jié)和協(xié)同作用，才能使木聚糖完全降解。斑玉蕈生長發(fā)育過程分泌木聚糖酶較多，因此可以作為判斷菌包成熟度的指標。木聚糖酶活力隨斑玉蕈菌包培養(yǎng)時間的變化見圖2。

圖2 木聚糖酶活力隨斑玉蕈菌包培養(yǎng)時間的變化Fig.2 Change in xylanase activity of Hypsizygus marmoreus bag with incubation time

從圖2可以看出，菌包木聚糖酶活力隨著斑玉蕈菌包培養(yǎng)時間增加，酶活力也隨之逐步增高：菌包長滿菌袋后，木聚糖酶活力從上部到下部逐步增強，酶活逐漸上升，到110 d之后就基本穩(wěn)定；隨斑玉蕈菌包培養(yǎng)時間而不斷增大，到后期上、中、下部的酶活力基本相同。主要原因是木聚糖酶可以分解木聚糖成為木糖，為菌包生長提供能量。經木聚糖酶活力變化方差分析（見表2） 表明，60 d菌包上、中、下部木聚糖酶酶活力差異顯著，140 d菌包上、中、下部木聚糖酶活力差異不顯著。2．1．3淀粉酶活力變化

表2 木聚糖酶活力變化的方差分析Tab.2 Variance analysis on xylanase activities of Hypsizygus marmoreus bag

淀粉酶是水解淀粉和糖原酶類的統(tǒng)稱。斑玉蕈培養(yǎng)料中含有大量淀粉，需將其水解后才能供給菌絲生長發(fā)育，因此淀粉酶也是斑玉蕈碳代謝中關鍵酶之一。淀粉酶活性隨斑玉蕈菌包培養(yǎng)時間的變化見圖3。

圖3 淀粉酶活性隨斑玉蕈菌包培養(yǎng)時間的變化Fig．3 Change in amylase activity of Hypsizygus marmoreus bag with incubation time

從圖3可以看出，淀粉酶活性在60 d～80 d時出現(xiàn)一個高峰，之后就逐漸降低。原因可能是斑玉蕈淀粉酶是誘導酶，隨著淀粉含量的減少酶活力逐步下降。100 d過后，菌絲已經基本后熟完成，此時的生長速度下降，酶活也降低并且較穩(wěn)定，保持在20 U·mL-1左右。淀粉酶活性變化經方差分析（見表3）表明，70 d淀粉酶活性與110 d淀粉酶活性差異極顯著，110 d～140 d淀粉酶活性差異不顯著。

表3 淀粉酶活性變化的方差分析Tab．3 Variance analysis on xylanase activities of Hypsizygus marmoreus bag

2．1．4 中性蛋白酶活力變化

通過中性蛋白酶可把動植物的大分子蛋白質水解成小分子肽或氨基酸，以利于蛋白質的有效吸收和利用。蛋白酶在菌絲吸收氮素營養(yǎng)過程中起著至關重要的作用。菌絲生長發(fā)育所需要的氮源來自蛋白酶的水解作用。中性蛋白酶活性隨培養(yǎng)時間的變化及方差分析見圖4和表4。

由圖4可以看出，中性蛋白酶活力隨著斑玉蕈菌包培養(yǎng)時間不斷降低，可能原因是栽培料中的豆粕等有機氮逐漸用完，因此蛋白酶的需求量降低。由表4方差分析表明，60 d中性蛋白酶活性顯著高于140 d中性蛋白酶。

圖4 中性蛋白酶活性隨斑玉蕈菌包培養(yǎng)時間的變化Fig．4 Change in proteinase activity of Hypsizygus marmoreus bag with incubation time

表4 中性蛋白酶活性變化的方差分析Tab．4 Variance analysis on proteinase activities of Hypsizygus marmoreus bag

2．1．5 漆酶活力變化

據(jù)研究發(fā)現(xiàn)很多食用菌菌體中富含漆酶。在菌體生長過程漆酶不僅參與木質素的降解，為菌體生長提供養(yǎng)料；同時還會產生酚類或醌類化合物抑制雜菌生長，還參與菌包轉色過程，影響產品的產量和質量。漆酶活性隨斑玉蕈菌包培養(yǎng)時間的變化情況及方差分析見圖5和表5。

由圖5可以看出，菌包上部漆酶活力在70 d達到最高值，隨后降低至平均水平；中部與下部漆酶活力在100 d達到最大峰值，隨后各部分酶活力有波動，總體維持在200 U·L-1左右。表5方差分析表明70 d菌包上、中、下部漆酶活力有顯著差異，110 d～130 d菌包上、中、下部漆酶活性差異不顯著。2．1．6 錳過氧化物酶活力變化

錳過氧化物酶活性隨斑玉蕈菌包培養(yǎng)時間的變化情況及方差分析見圖6和表6。

錳過氧化物酶與木質素的降解密切相關。木質素是高等植物的主要成分之一，主要存在于細胞壁中，占植物細胞壁的15%～30%。木質素和半纖維素一起包圍著纖維素。在斑玉蕈培養(yǎng)階段，隨著栽培時間的延長，錳過氧化物酶活性逐漸增強，才能先分解木質素，再攝取細胞中更多的營養(yǎng)，為其生長發(fā)育所用。在菌絲后熟期間，錳過氧化物酶的活性呈上升的趨勢，菌絲后熟完成之后活性略有下降。各部分遵循先逐漸增高而后慢慢降低的規(guī)律：上部在80 d達到最大峰值，中部在90 d達到最大峰值，下部在110 d～120 d達到峰值，酶活力有41 U·mL-1（圖6）。經方差分析表明，120 d菌包下部錳過氧化物酶活力顯著高于60 d菌包下部錳過氧化物酶活力。

圖5 漆酶活性隨斑玉蕈菌包培養(yǎng)時間的變化Fig.5 Change in laccase activity of Hypsizygus marmoreus bag with incubation time

表5 漆酶活性變化的方差分析Tab.5 Variance analysis on laccase activities of Hypsizygus marmoreus bag

2.2 菌包成熟度與生物學效率的關系

本研究采用工廠化穩(wěn)定生產中的斑玉蕈菌包作為試驗材料，在環(huán)境條件、培養(yǎng)料的營養(yǎng)配比、料水氣比例、菌種一致情況下，測定其前期酶活性變化，同時做了出菇管理實驗，測定了菌包生物學效率。并參照作者之前發(fā)表文章[20]，從而可以為分析酶活力與出菇產量以及生物學效率之間關系提供依據(jù)。菌包培養(yǎng)時間對菌絲恢復泛白時間無影響，但是對原基形成時間和采摘時間有顯著影響。不同培養(yǎng)時間出菇產量和生物學效率各不相同，110 d之前產量和生物學效率隨著培養(yǎng)天數(shù)增加而增加，110 d之后差異不顯著。菌包不同培養(yǎng)時間出菇外觀有明顯的差別，但出菇時間不影響子實體色澤。培養(yǎng)時間加長對子菌蓋厚度和子實體含水量影響也不顯著，但是對菌蓋大小和菌柄柄長度有影響。

圖6 錳過氧化物酶活性隨斑玉蕈菌包培養(yǎng)時間的變化Fig.6 Change in manganese peroxidase activity of Hypsizygus marmoreus bag with incubation time

表6 錳過氧化物酶活性變化的方差分析Tab.6 Variance analysis on manganese peroxidase activities of Hypsizygus marmoreus bag

3 討論

本研究采用工廠化生產中的斑玉蕈菌包作為試驗材料，設置平行和對照并進行顯著性分析。試驗結果表明，后熟期不足導致原基形成晚，采摘時間推遲，成品率低下；后熟期過長產量增加不明顯，并且增加了企業(yè)生產成本。因此本研究結果可為建立斑玉蕈菌包成熟度判定方法提供參照，為斑玉蕈工廠化生產過程中選擇正確出菇時間提供理論支持。

菌包菌絲體生長階段，是培養(yǎng)料及菌絲體生理成熟度不斷提高和積累的過程。在環(huán)境條件適宜、培養(yǎng)料營養(yǎng)配比得當、料水氣比例合適，菌種優(yōu)良的前提下，斑玉蕈培養(yǎng)期間的一切變化都有一定規(guī)律，可根據(jù)前期表現(xiàn)預測后期結果。但是，纖維素酶活力在6 U·mL-1～8 U·mL-1波動，后期增長不明顯，這與對白靈菇的研究結果不同[20]。菌包內含有大量纖維素，長期需要纖維素酶，但本文該酶降解緩慢，其原因不明。淀粉酶活力變化趨勢與平菇液體培養(yǎng)及白靈菇、金針菇固體培養(yǎng)相似[21-23]，在后熟期后期活性低。由于淀粉酶可能是一種誘導酶，前期培養(yǎng)料中含有較高的淀粉，淀粉酶活力較高，后期淀粉分解含量低時，酶活力顯著下降。蛋白酶活力在無子實體形成時活力低，與王玉萬的研究結果相似[24]，并且逐漸降低。這是因為培養(yǎng)料中如豆粕等有機蛋白消耗完后，蛋白酶活力下降。木聚糖酶活力逐漸升高并且上部＞中部＞下部，后期上、中、下部活力差距減小，主要原因是木聚糖酶可以分解木聚糖成為木糖，為菌包生長提供能量。這與周晨妍、胡奎娟等人研究結果有所不同[16，25]，可能是由于黑曲霉、木霉與斑玉蕈物種間的差異，導致酶活變化不呈“鐘”狀。上、中、下部漆酶活力都依次先上升后降低，后期差異不大，在200 U·L-1左右波動。因為漆酶不僅參與木質素降解，為菌體生長提供養(yǎng)料，同時還產生酚類或醌類化合物抑制雜菌生長，并且參與菌包轉色過程，影響產品產量和質量[11]。錳過氧化物酶活力變化趨勢與張丁倩研究結果相似[19]，前期上部＞中部＞下部，后期下部和中部逐漸超過上部，研究發(fā)現(xiàn)當菌包下部酶活力超過中上部達到最高值即40 U·mL-1時，出菇品質好，產量高。

從培養(yǎng)過程中斑玉蕈的木聚糖酶、漆酶、錳過氧化物酶等的活性變化可以看出，培養(yǎng)60 d～90 d這段階段酶活力波動較大，此時菌絲生長處于旺盛階段；110 d～120 d階段酶活力相對較平穩(wěn)，說明此時菌絲生長已經基本達到生理后熟期；超過130 d酶活力又有大幅度變化，此時菌絲生長超過一定的成熟度，產量有相應的下降。在23℃溫度培養(yǎng)下，菌絲培養(yǎng)120 d，漆酶、木聚糖酶活力上、中、下趨于一致時，表示菌包已經成熟，產量最高。因此，斑玉蕈工廠化生產菌包培養(yǎng)后熟不夠或過熟都會影響產量和外觀品質。

研究斑玉蕈菌絲體生長階段培養(yǎng)料各種關鍵酶活規(guī)律的意義在于：掌握菌絲體生長階段酶活規(guī)律，有助于對生產過程進行監(jiān)控，及時發(fā)現(xiàn)問題、提前解決問題，最大程度地降低因斑玉蕈生產周期長而帶來的技術風險；根據(jù)該變化規(guī)律，能夠對新工藝、新技術的開發(fā)提供較為快捷的判斷標準或參考；把研究斑玉蕈菌絲體生長階段酶活變化規(guī)律的方法應用到其他菇類上，有助于提高對其它菇類生物學特征的認識，更好地指導生產。

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Relationship Between Enzyme Activities and the Maturity of Hypsizygus marmoreous Bag

ZHANG Zhi-shi1,LIN Hui2,WANG Li-fen2,CHEN Gui-zhen2,LAI Shu-fang1, ZHAN Sen-ran1,LI Jia-huan1,SUN Shu-jing1,2,HU Kai-hui1,2
(1．College of Life Sciences,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China; 2．Gutian Edible Fungi Research Institute,Fujian Agriculture and Forestry University,Gutian 352200,China)

In order to establish a scientific and reliable biological parameters evaluation index of Hypsizygus marmoreus bag maturity and provide a scientific basis for judgment of the industrialized H.marmoreus bag maturity,the relationship between cellulase,xylanase,amylase,proteinase,laccase,manganese peroxidase activities and different incubation time were analysed by 3,5-dinitrosalicyic acid method,Iodine-potassium iodide method,Folin-phenol method,ABTS method,Guaiacol method respectively．The results showed that cultivated about 120 days at 21℃-25℃,xylanase activities of the various parts of the fungi bag were about 13．7 U·mL-1and in upper part laccase activity reach maximum at 70 days,middle and lower part laccase activity reach maximum at 100 days,and various parts laccase activities of the fungi bag were about 173．5 U·L-1at 120 days．Cellulase activities were about 6 U·mL-1-8 U·mL-1．Amylase activities were about 20 U·mL-1．Proteinase activities were about 4 U·mL-1．Lower part anganese peroxidase activity reach 40 U·mL-1．The production of this period is up to 461．7 g·bag-1．

Hypsizygus marmoreus;enzyme activities;biological efficiency

S646.9

A

1003-8310（2016）01-0053-06

10．13629/j．cnki．53-1054．2016．01．015

福建省高校產學合作科技重大項目（2013N5101）；珍稀食用菌品種創(chuàng)新與自動化生產技術產業(yè)化工程（2014S1477-8）；福建省食用菌產業(yè)技術重大研發(fā)平臺（2014N2101）；福建省重大農技推廣項目（KNJ-153000）。

張職視（1991-），男，碩士研究生，主要從事食用菌開發(fā)與利用研究。E-mail:746830163＠qq．com

**通信作者：胡開輝（1962-），男，本科，教授，主要從事食用菌栽培與遺傳育種研究。E-mail:2692609765＠qq．com

2015-11-01