皺蓋假芝化學成分分離及其結構鑒定*

黃紀國，韓園園，謝意珍，潘鴻輝**

（1．廣東省微生物研究所省部共建華南應用微生物國家重點實驗室，廣東 廣州 510070；2．廣東粵微食用菌技術有限公司，廣東 廣州 510663）

〈生理生化〉

皺蓋假芝化學成分分離及其結構鑒定*

黃紀國1，2，韓園園1，謝意珍1，2，潘鴻輝1，2**

（1．廣東省微生物研究所省部共建華南應用微生物國家重點實驗室，廣東 廣州 510070；2．廣東粵微食用菌技術有限公司，廣東 廣州 510663）

對皺蓋假芝（Amauroderma rude）子實體提取物的化學成分進行分離及結構鑒定。皺蓋假芝子實體經干燥、粉碎，采用熱水浸提，依次采用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，最終得到氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及水溶物；采用各種分離手段，從皺蓋假芝提取物中分離出6個化合物單體，并通過現代波譜分析方法及結合文獻，最終確定為尿苷、5’-甲氧基尿苷、星魚甾醇、腺苷、尿嘧啶、原兒茶酸，所有化合物均屬首次從皺蓋假芝中分離得到。

皺蓋假芝；化學成分；星魚甾醇；原兒茶酸

靈芝屬于擔子菌綱（Basidioycetes） 多孔菌科（Polyporaceae）靈芝亞科 （Ganodermatoideae）靈芝屬（Ganoderma）。因其具有滋補強壯，延年益壽等功效，受到廣泛關注[1]。目前，已從靈芝中分離得到150多種化合物，其中包括三萜類、多糖類、蛋白類、多肽類、核苷類、甾醇類、揮發油、生物堿、甘露醇、多種酶類、呋喃衍生物、脂肪酸和微量元素等。據報道，靈芝活性成分具有抗腫瘤、抗氧化、調節免疫、降血糖、降血脂、保肝護肝等功效，且幾乎無毒副作用，受到醫藥界的廣泛重視[2-10]。而皺蓋假芝（Amauroderma rude） 屬于靈芝科（Ganodermataceae）假芝屬（Amauroderma），目前全球發現的大概30多種[11]，主要分布于熱帶及亞熱帶地區，我國華南及西南地區。因其子實體受外界損傷而流出紅色液體或者子實體器官變紅，故又名血芝[12]。通過查閱文獻發現，國內外對于皺蓋假芝的研究主要是資源分布及液體發酵[12-14]，2013年本實驗室曾經對皺蓋假芝抗癌活性進行研究，發現其抗癌活性明顯高于其他食用菌[15]。為更加全面了解皺蓋假芝子實體的化學成分，本實驗采用正相色譜、反相色譜分離方法，并結合波譜分析手段，對分離出的化學成分進行結構鑒定，最終確定6個化合物單體結構，均屬首次從皺蓋假芝子實體中分離得到。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

X-4型顯微熔點儀，上海精密科學儀器有限公司；安捷倫1200高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；島津LC-2OA色譜儀，日本島津科技有限公司；DRX-500M核磁共振儀，瑞士布魯克公司；BRUKER HCT電噴霧電離質譜，美國布魯克道爾頓公司；RE-3000旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；BS210S BL610電子天平，德國賽多利斯公司；SK8200H超聲波清洗器，上海科導超聲儀器有限公司；DLSB-5/20型低溫冷卻液循環泵，鄭州長城科工貿有限公司；SHB-S循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；高效硅膠薄層板、柱層析硅膠，青島海洋化工分廠；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20，上海安瑪西亞生物技術有限公司；乙醇、甲醇、石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、三氯甲烷均為分析純，廣州化學試劑二廠；氘代試劑，北京伊諾凱科技有限公司。

皺蓋假芝購自安徽大別山種植戶，并經廣東省微生物研究所食用菌研究發展中心鑒定。

1.2 分離流程

干燥的皺蓋假芝子實體（5 kg）經粉碎，采用熱水浸提（液質比1:25，提取溫度100℃，提取時間2×1 h），過濾，常溫真空濃縮，得到皺蓋假芝水提濃縮液（736 g）；對濃縮液進一步采用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，分別得到氯仿萃取物（135 g）、乙酸乙酯萃取物（155 g）、正丁醇萃取物（171 g）、水溶性提取物。對氯仿萃取物（135 g）進行正相硅膠柱層析，采用氯仿和石油醚洗脫系統，進行梯度洗脫（氯仿:石油醚為0:100至100:0），最終用甲醇沖柱，經薄層色譜分析得到5個組分。其中，組分Fr 1-1中出現結晶析出，過濾、重結晶，得到化合物3（8 mg）。對正丁醇萃取物（171 g）進行D101大孔樹脂進行分離，采用水-乙醇進行梯度洗脫（100:0至0:100），最終得到20個組分。其中Fr 3-1～Fr 3-3放入冰箱靜置24 h，大量白色沉淀析出。收集白色沉淀進行葡聚糖凝膠柱層析，采用純水進行洗脫，得到5個組分。對組分Fr 3-1-1進行HPLC制備，得到化合物1（tR=2．349 min） （5 mg）；對組分Fr 3-1-2進行HPLC制備，得到化合物2（tR=2．357 min）（6 mg） 和化合物6（tR=5．82 min）（8 mg）；對組分Fr 3-1-3進行HPLC制備，得到化合物4（tR=4．99 min）（5．1 mg）；對組分Fr 3-1-4進行HPLC制備，得到化合物5（tR=8．567 min）（6 mg）。其化合物結構見圖1。

圖1 化合物1～6的結構式Fig．1 Structure formula of compounds 1-6

2 結構鑒定結果

化合物1：白色粉末。1H NMR (DMSO,500 MHz) δ：7．90 (1H,d,J=7．95 Hz,H-6)，5．79 (1H,d,J=5．35 Hz,H-1’)，5．66 (1H,d,J=7．95 Hz,H-5)，4．03 (1H,t,J=4．17 Hz)，3．97 (1H,s)，3．85 (1H,d,J=2．45 Hz)，3．59 (2H,m)；13C NMR (DMSO,125 MHz)δ：161．73 (C-4)，149．33 (C-2)，139．36 (C-6)，100．36 (C-5)，86．26 (C-1’)，83．41(C-4’)，72．11(C-3’)，68．44(C-2’)，59．39 (C-5’)。經與參考文獻數據對比[16]，其與尿苷數據一致，最終確定其為尿苷。

化合物2：1H NMR (DMSO,500 MHz)δ：7．89 (1H,d,J=8．1 Hz,H-6)，5．77 (1H,d,J=5．4 Hz, H-1’)，5．64 (1H,d,J=8．1 Hz,H-5)，4．01 (1H,t, J=5．2 Hz)，3．95 (1H,t,J=5．2 Hz)，3．95 (1H,t,J =4．4 Hz)，3．83 (1H,q,J=3．3 Hz)，3．54 (2H,dq,J =3．05,4．0 Hz,H-5’)，3．38 (3H,s,C-5’-OCH3)；13C NMR (DMSO,125 MHz)δ：163．1(C-4)，150．7 (C-2)，140．7 (C-6)，101．7 (C-5)，87．6 (C-1’)，84.8 (C-4’)，73.5 (C-3’)，69.8 (C-2’)，63.0 (C-5’-OCH3)，60.8(C-5’)。通過與尿苷的波譜數據對比，結合HMBC和HSQC，最終確定化合物C-5’羥基被甲氧基取代，最終確定化合物為5’-甲氧基尿苷。

化合物3：白色針狀晶體，溶解于氯仿，熔點170℃～172℃；分子式C28H46O。1H NMR (CDCl3,500 MHz)δ：5.16～5.25 (3H,m)，3.58～3.66 (1H,m)，1.03 (3H,d,J=6.65 Hz)，0.94 (3H,d,J=6.8 Hz)，0.85 (6H,t,J=7.2 Hz)，0.82 (3H,s)，0.57 (3H, s)；13C NMR (CDCl3,125 MHz)δ：139.55 (C-8)，135.66 (C-22)，131.86 (C-23)，117.44 (C-7)，71.06 (C-3)，55.93 (C-17)，55.09 (C-14)，49.42 (C-9)，43.28 (C-13)，42.79 (C-24)，40.48 (C-20)，40.24 (C-5)，39.43 (C-12)，37.94 (C-4)，37.12 (C-1)，34.20 (C-10)，33.07 (C-25)，31.43 (C-6)，29.61 (C-2)，28.09 (C-16)，22.91 (C-15)，21.52 (C-11)，21.1 (C-21)，19.94 (C-27)，19.63 (C-26)，17.58 (C-28)，13.03 (C-19)，12.07 (C-18)。與參考文獻報道的Ergosta7，22-dien-3β-ol波譜數據一致[17]，最終確定化合物為星魚甾醇。

化合物4：白色無定形粉末。1H NMR(DMSO+ D2O,500 MHz)δ：6.06 (1H,d,J=1.95 Hz)，5.91 (1H,d,J=2.8 Hz)，3.74 (1H,d,J=6.3 Hz)，2.11 (1H,s)，1.98 (1H,d,J=2.2 Hz)，1.51～1.62 (2H, m)；13C NMR (DMSO+D2O,125 MHz)δ：156.95 (C-6)，153.95 (C-2)，149.88 (C-4)，142.09 (C-8)，120.41 (C-5)，89.73 (C-1’)，87.38 (C-4’)，75.12 (C-2’)，72.11 (C-3’)，63.02 (C-5’)。經查閱文獻，其與報道的化合物腺苷化學位移一致[18]，最終確定化合物為腺苷。

化合物5：白色晶體，335.1℃～336℃。1H NMR (DMSO,500 MHz)δ：11.0 (1H,s)，10.8 (1H,s)為活潑氫；13C NMR (DMSO+D2O,125 MHz)δ：163.9 (C-4)，151.9 (C-2)，141.7 (C-6)，99.7 (C-5)，通過查閱文獻，其與報道的尿嘧啶數據一致[19]，最終確定其化合物為尿嘧啶。

化合物6：白色粉末。1H NMR (DMSO,500 MHz)δ：7.28 (1H,d,J=1.9 Hz,H-2)，7.20 (1H, dd,J=1.9 8.2 Hz,H-6)，6.73 (1H,d,J=8.2 Hz, H-5)；13C NMR (DMSO,125 MHz)δ：168.3 (C-7)，148.8 (C-4)，145.1 (C-3)，126.0 (C-6)，119.8 (C-1)，115.8 (C-2)，115.1 (C-5)。經過查閱文獻，發現其與報道的原兒茶酸波譜數據一致[20]，最終確定化合物為原兒茶酸。

3 討論

皺蓋假芝為一種藥食兼用真菌。本實驗從皺蓋假芝中分離出6個化合物單體，均為首次從皺蓋假芝中分離得到。其中化合物星魚甾醇具有提高免疫調節作用[21]，原兒茶酸具有治哮喘、抗菌、抗氧化、抗炎、抗高血糖以及神經保護的等作用。魏苗苗等[22]發現原兒茶酸能顯著抑制MAPK（p38,ERK）以及NF-κB（IκB-α，NF-κB p65）通路的激活，能夠有效地改善致敏懸液（OVA）引起的小鼠過敏性哮喘。張秀麗等[23]通過對魚藤酮誘導的帕金森模型小鼠腦組織中相關抗氧化酶活性的觀察，發現原兒茶酸可提高帕金森模型小鼠中腦和紋狀體內超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活力，降低脂質過氧化物丙二醛（MDA）含量，減輕魚藤酮誘導的腦組織損傷，減少體內自由基的產生，從而達到神經保護作用。據報道，不同濃度的原兒茶酸對HBV啟動子（HBV-S1P、HBV-S2P、HBV-CP、HBV-XP、HBV-FP）均有不同程度的抑制作用。原兒茶酸體外抗HBV的相關分子作用機制，表現在對FP啟動子的抑制作用呈現倒U型：當濃度為1 μg·mL-1時，抑制作用最大；其次原兒茶酸對信號通路的啟動子AP-1和NF-KB也有抑制作用且呈現劑量依賴關系，即當濃度達到10 μg·mL-1時，抑制作用達到最大，其中AP-1的抑制率達到66.4%，NF-K B的抑制率達到31.2%。因此原兒茶酸對HBV啟動子及信號通路的啟動子的抑制，是抑制HBV復制的重要途徑之一[24]。通過對皺蓋假芝化學成分的分離及結構鑒定，為全面了解和開發皺蓋假芝提供科學依據。

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Constituents Extract from the Fruit Bodies of Amauroderma rude

HUANG Ji-guo1,2,HAN Yuan-yuan1,XIE Yi-zhen1,2,PAN Hong-hui1,2
(1．Guangdong Institute of Microbiology,State Key Laboratory of Applied Microbiology,South China (The Ministry Province Joint Development),Guangzhou 510070,China;2．Guangdong Yuewei Edible Fungi Technology Co．Ltd．,Guangzhou,Guangzhou 510663,China)

The chemical constituents extracts from Amauroderma rude and structure identification were studied．The chemical constituents of A.rude fruit bodies were studied．Six compounds were isolated by various chromatographic techniques from A. rude and their structures were elucidated on the basis of spectroscopic analysis,namely uridine,5’-methoxyuridine,stellasterol, adenosine,uracil,protocatechuic acid．All compounds were isolated from A.rude for the first time．

Amauroderma rude;chemical constituents;stellasterol;protocatechuic acid

S646.9

A

1003-8310（2016）01-0042-04

10．13629/j．cnki．53-1054．2016．01．012

廣東省產學研省部合作專項基金項目（2012B090600050）；廣東省工程技術研究開發中心建設項目（2010B080100068）；廣東省自然科學基金項目（2015A030313711）。

黃紀國（1986-），男，碩士，助理研究員，從事食（藥）用真菌研究及開發工作。E-mail:huangjiguo＠126．com

**通信作者：潘鴻輝（1979-），女，博士，副研究員，從事食（藥）用真菌研究及開發工作。E-mail:phhcys＠yahoo．com

2015-11-02