多環(huán)芳烴降解菌的篩選及其在焦化場地污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用*

李鳳梅 郭書海 張燦燦 張玲妍 楊雪蓮

(1.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧 沈陽 110016；2.沈陽大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 沈陽 110044)

多環(huán)芳烴(PAHs)是焦化場地土壤中主要的污染物之一，主要來源于煤的不完全燃燒及焦油、煤氣等化工產(chǎn)品的加工過程，因其穩(wěn)定性好、疏水性強，可長期吸附在土壤顆粒中而難以降解[1-3]。CANET等[4]曾報道國外某焦化廠的土壤中16種PAHs質(zhì)量濃度總和為423 mg/kg。加利福尼亞某人造煤氣工廠的土壤中PAHs質(zhì)量濃度達到2 484 mg/kg[5]。馮嫣等[6]報道北京某廢棄焦化廠的土壤中PAHs質(zhì)量濃度達144.8 mg/kg，土壤表層聚集了大量3、4環(huán)PAHs。PAHs為有毒物質(zhì)，具有極強的致癌、致畸及致突變作用[7-8]。焦化場地土壤中的PAHs可通過揚塵及地表徑流進入生物體和沉積物中，對人類健康和生態(tài)環(huán)境造成危害。因此，焦化場地PAHs污染土壤的修復(fù)已成為亟待解決的問題。

微生物修復(fù)是降解土壤中PAHs的主要途徑，微生物修復(fù)對PAHs的降解效果受多種因素影響，如營養(yǎng)物質(zhì)含量、氧含量、pH、降解菌種類和數(shù)量、污染物的生物有效性等，其中降解菌種類和數(shù)量對PAHs降解率的影響較大。向土壤施加外源高效PAHs降解菌能直接改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，增加土壤PAHs降解菌數(shù)量和活性，是一種具有針對性的微生物原位修復(fù)手段[9-15]。迄今為止，國內(nèi)外學(xué)者對降解PAHs的微生物進行了廣泛研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的能夠降解PAHs的微生物有70多個屬200余種[16]。但在實際應(yīng)用中，由于污染物性質(zhì)、土壤成分不同，且土壤中的土著微生物可能會對外源微生物的生長造成抑制，導(dǎo)致外源微生物對PAHs的降解率偏低。因此，有必要針對污染土壤的特點進行微生物的篩選，進而提高PAHs降解率。

沈陽某焦化廠由于老廠搬遷，場地遺留大量的污染土壤，PAHs濃度大，且中環(huán)(4、5環(huán))PAHs所占的比例較高，在土地重新利用之前，必須進行土壤修復(fù)。本研究以該焦化場地污染土壤為研究材料，進行PAHs降解菌富集、篩選和鑒定，并實施微生物修復(fù)實驗。研究成果對焦化場地受PAHs污染土壤的微生物修復(fù)具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 污染土壤采集

污染土壤采自沈陽某焦化廠受PAHs污染的表層(0～10 cm)土壤，除去石塊后過10目篩，放入自封袋中，封口，4 ℃保存。對污染土壤進行3次重復(fù)測定，取平均值，得出其基本理化性質(zhì)為：pH 8.34、含水率18.9%、有機碳26.30 g/kg、總氮1.56 g/kg、總磷3.12 g/kg。PAHs質(zhì)量濃度總和為5 672.00 mg/kg，檢出的13種PAHs均為美國環(huán)境保護署(USEPA)優(yōu)先控制PAHs，各種PAHs的質(zhì)量濃度及質(zhì)量分數(shù)見表1。土壤中以中環(huán)PAHs為主，占PAHs總和的75.21%。

1.2 培養(yǎng)基配制

無機鹽液體培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制參見《微生物學(xué)實驗》[17]84-86。

無機鹽固體培養(yǎng)基：在無機鹽液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入15 g瓊脂粉。

血平板培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基于121 ℃下滅菌20 min，冷卻至50 ℃后加入5%(體積分數(shù))無菌脫纖維綿羊血，搖勻后傾倒平板。

1.3 實驗方法

PAHs降解菌的富集、分離和純化：稱取10 g污染土壤加入50 mL已滅菌的無機鹽液體培養(yǎng)基中，在搖床中于30 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)5 d；靜置1 h后取上清液1 mL，接入裝有20 g污染土壤的50 mL已滅菌無機鹽液體培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)5 d；循環(huán)2次。取循環(huán)培養(yǎng)2次后的上清液1 mL，采用稀釋平板法在無機鹽固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，其中PAHs質(zhì)量濃度總和為500 mg/kg，各種PAHs比例與表1相同。培養(yǎng)5 d后，根據(jù)菌落形態(tài)挑取長勢良好且數(shù)量較多的菌落，將其在含有500 mg/kgPAHs的無機鹽固體培養(yǎng)基中進行劃線培養(yǎng)，直至得到單一菌落，純化后的菌株保存于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面中。

表1 污染土壤中各種PAHs的質(zhì)量濃度及質(zhì)量分數(shù)

注：1)為平均值±標準差，表2、表3同。

PAHs降解菌的篩選：利用初步降解實驗進行PAHs降解菌的篩選。將純化的菌株培養(yǎng)后用無菌生理鹽水分別制成109cfu/mL的菌懸液。稱取污染土壤10 g，溶于20 mL已滅菌的無機鹽液體培養(yǎng)基中，配成污染土壤泥漿；在無菌條件下，取菌懸液2 mL接種于污染土壤泥漿中，并分別作加氯化汞滅菌和不滅菌2種對照。每種處理做3個重復(fù)，在搖床中于30 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)15 d，測其PAHs濃度，篩選出PAHs總降解率較高的菌株。

表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選：利用血平板實驗進行表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選。分別挑取活化的PAHs降解菌點接于血平板培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)24 h。若有溶血圈出現(xiàn)，證明該菌株能產(chǎn)生表面活性劑。

微生物修復(fù)實驗：稱取污染土壤2 kg，將篩選的菌株經(jīng)活化后制成菌懸液接種到土壤中混勻，混勻后土壤菌落數(shù)為108cfu/g。為了與原土壤環(huán)境相近，土壤含水率基本保持在20%左右，微生物修復(fù)在自然條件下進行。在相同條件下與未接種菌株的土壤做對照，在培養(yǎng)10、20、30、40、60 d時分別取樣。

1.4 分析方法

PAHs測定：PAHs提取參照《水質(zhì) 多環(huán)芳烴的測定 液液萃取和固相萃取高效液相色譜法》(HJ 478—2009)[18]和USEPA推薦的超聲萃取法[19]。采用Waters 1525高效液相色譜儀測定PAHs濃度。色譜柱為Waters Symmetry C18分離柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)，測定過程中，柱溫為25 ℃，進樣量為10 μL，流速為1 mL/min，流動相為乙腈和水。用保留時間和峰高，配合PAHs混合標準液為外標定量計算PAHs濃度。

菌株鑒定：參考《微生物學(xué)實驗》[17]54-59和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[20]對篩選出的菌株進行形態(tài)觀察，16S rRNA基因序列由上海某生物技術(shù)有限公司測定，將測序結(jié)果與美國國立生物信息技術(shù)中心(NCBI)Genbank數(shù)據(jù)庫中的16S rRNA基因序列進行同源性比對，根據(jù)形態(tài)觀察及同源性比對結(jié)果鑒定到屬。

2 結(jié)果與討論

2.1 PAHs降解菌篩選

經(jīng)富集、分離和純化，從焦化場地污染土壤中共獲得7株菌株，記為B1～B7。B1～B7在含PAHs的無機鹽固體培養(yǎng)基中均能生長。對純化后的菌株進行初步降解實驗，測定其對PAHs的總降解率，結(jié)果見表2。由表2可以看出，經(jīng)15 d降解后，B1～B7均具有一定的PAHs降解能力，但對PAHs的降解能力存在差異，PAHs總降解率平均值最高可達到44.3%，最低為26.1%。接種B4、B5和B7后，PAHs總降解率分別為41.7%、44.3%、42.8%，均達到40%以上，因此本研究將B4、B5和B7篩選為高效PAHs降解菌。

2.2 表面活性劑產(chǎn)生菌篩選

由于表面活性劑具有降低表面張力的作用，可使血平板中的紅細胞破裂并釋放血紅素，導(dǎo)致血平板上出現(xiàn)溶血圈，因此本研究采用血平板實驗進行表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選。將分離得到的B1～B7點接于血平板培養(yǎng)基中，28 ℃下培養(yǎng)24 h后測量溶血圈直徑并記錄結(jié)果。B2和B7產(chǎn)生了溶血圈，B2的溶血圈直徑明顯大于B7(見表2)，并且連續(xù)轉(zhuǎn)接后性狀穩(wěn)定。因而，將B2篩選為高效表面活性劑產(chǎn)生菌。

2.3 不同處理條件對比

B2為高效表面活性劑產(chǎn)生菌，能向環(huán)境中釋放表面活性劑，降低疏水性污染物表面張力，促進微生物吸收和代謝PAHs，從而加速PAHs的降解[21],[22]891,[23]。因此，將B2分別與B4、B5、B7等質(zhì)量混合，接種于污染土壤泥漿中，在搖床中于30 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)9 d，比較PAHs總降解率。

表2 PAHs總降解率和溶血圈直徑

表3展示了不同處理條件下PAHs總降解率隨時間的變化。由表3可以看出，加氯化汞滅菌的對照組PAHs總降解率很低，基本保持在8%左右，這可能是PAHs揮發(fā)或被瓶壁吸附造成。不滅菌的對照組PAHs總降解率隨時間的延長逐漸增加，在9 d時平均值達到26.4%，說明污染土壤中存在的土著微生物可能對PAHs有一定的降解作用。接種菌株后，在3 d時的PAHs總降解率平均值為21.0%～31.0%，明顯高于對照組，說明部分PAHs被PAHs降解菌所利用。在9 d時不同菌株對PAHs的總降解率表現(xiàn)為：B4+B2>B5>B5+B2>B7+B2>B7>B4>B2，說明添加B2總體上能提高PAHs總降解率，其中接種B4+B2后，PAHs總降解率平均值在9 d時達到45.9%。其原因可能是表面活性劑提高了PAHs的生物有效性，這與前人的研究結(jié)果一致[22]890,[24-25]。

表3 不同處理條件下PAHs總降解率隨時間的變化

2.4 菌株鑒定

采用形態(tài)觀察和16S rRNA基因序列比對對B2和B4進行鑒定。在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，B2的菌落為乳白色、圓形，邊緣規(guī)則，質(zhì)地光滑，表面扁平，革蘭氏染色呈陰性，無芽孢；B4的菌落為灰白色、圓形，不透明，邊緣不規(guī)則呈葉裂狀，質(zhì)地粗糙，表面隆起，革蘭氏染色呈陽性，有芽孢。

利用細菌16S rRNA基因序列的通用引物F27(基因序列為5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和R1492(基因序列為5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)進行擴增，得到1 400 bp左右的16S rRNA基因序列，進行同源性比對。比對結(jié)果表明，B2和B4歸為2個不同的屬。B2與假單胞菌屬(Pseudomonassp.)多個菌株的基因序列相似性均在99%以上；B4與芽孢桿菌屬(Bacillussp.)多個菌株的基因序列相似性達到99%以上。結(jié)合B2和B4的菌落形態(tài)及16S rRNA基因序列比對結(jié)果，可確定B2為假單胞菌屬，B4為芽孢桿菌屬。假單胞菌屬和芽孢桿菌屬是目前發(fā)現(xiàn)的PAHs降解菌種類最多、降解范圍最廣的菌屬，已發(fā)現(xiàn)的菌株不僅可以降解低環(huán)(≤3環(huán))PAHs，還可以降解中環(huán)PAHs[26-27]。

2.5 微生物修復(fù)實驗

通過微生物修復(fù)實驗，進一步研究B4+B2在實際土壤環(huán)境中的PAHs總降解率。實驗組接種B4+B2，對照組不接種菌株。PAHs總降解率隨時間的變化如圖1所示。對照組的PAHs總降解率最高達28.3%，說明土壤存在的土著微生物能降解PAHs，土壤具有一定的自我修復(fù)能力。實驗組的PAHs總降解率在30 d內(nèi)迅速升高，隨后有所減緩。同一時間內(nèi)，實驗組的PAHs總降解率顯著高于對照組。在60 d時，實驗組的PAHs總降解率達到最大，為48.1%，高于對照組近20百分點。

圖1 微生物修復(fù)實驗中PAHs總降解率隨時間的變化Fig.1 Total degradation rates of PAHs varied with time in microbial remediation experiment

為進一步考察接種B4+B2后對不同環(huán)數(shù)PAHs降解效果的差別，分別計算了60 d時實驗組和對照組對13種PAHs的降解率，結(jié)果如圖2所示。實驗組3、4、5、6環(huán)PAHs的平均降解率分別為93.9%、54.6%、28.1%、6.3%，低環(huán)PAHs幾乎完全降解，中環(huán)PAHs部分降解，而高環(huán)(≥6環(huán))PAHs較少降解，土壤中13種PAHs隨著環(huán)數(shù)的增加，其降解率逐漸降低。與對照組相比，實驗組對3、4、5、6環(huán)PAHs的平均降解率分別提高3.8、34.1、25.1、4.4百分點，對中環(huán)PAHs的平均降解率提高29.6百分點。可見，接種B4+B2提高了土壤中各種PAHs的降解率，對中環(huán)PAHs的降解率提高最大，對高環(huán)PAHs的降解率也有較明顯的提高。

微生物修復(fù)實驗中，PAHs降解的難易程度不僅與PAHs分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，還與PAHs的物理化學(xué)性質(zhì)和PAHs降解菌的特性有關(guān)。微生物修復(fù)實驗?zāi)苡行Ы到馕廴就寥乐械牡铜h(huán)PAHs，但對高環(huán)PAHs降解率較低[28]。高環(huán)PAHs污染土壤修復(fù)的難點之一是高環(huán)PAHs的生物有效性較低；此外，污染土壤中的PAHs降解菌數(shù)量較少也是限制因素。本研究以沈陽某焦化廠高質(zhì)量濃度PAHs(5 672.00 mg/kg)污染土壤為研究對象，發(fā)現(xiàn)接種B2+B4對污染土壤具有良好的修復(fù)效果，對中環(huán)PAHs的降解率提高最大，對高環(huán)PAHs的降解率也有較明顯的提高。研究表明，PAHs降解菌的使用對焦化場地污染土壤的修復(fù)具有較大的應(yīng)用潛力。

圖2 微生物修復(fù)實驗中各種PAHs的降解率Fig.2 Degradation rates of individual PAHs in microbial remediation experiment

3 結(jié) 論

(1) 經(jīng)過富集、分離和純化，從沈陽某焦化廠的污染土壤中分離得到7株菌株B1～B7。其中，B4、B5、B7對PAHs的降解能力較為突出，在15 d時對PAHs總降解率分別為41.7%、44.3%、42.8%，為高效PAHs降解菌；B2為高效表面活性劑產(chǎn)生菌。

(2) B2能產(chǎn)生表面活性劑，提高PAHs的生物有效性，使混合菌株對PAHs的總降解率普遍高于單一菌株。B4+B2為降解PAHs的優(yōu)勢混合菌株，在9 d時PAHs總降解率平均值達到45.9%。經(jīng)形態(tài)觀察和16S rRNA基因序列比對，鑒定B2和B4分別歸于假單胞菌屬和芽孢桿菌屬。

(3) 接種B2+B4對污染土壤PAHs的微生物修復(fù)有明顯的強化作用，在60 d時PAHs總降解率達到48.1%；對中環(huán)PAHs降解率的提高尤為明顯，7種中環(huán)PAHs的平均降解率比不接種菌株的對照組提高29.6百分點。

[1] 王培俊,劉俐,李發(fā)生,等.煉焦過程中產(chǎn)生的污染物分析[J].煤炭科學(xué)技術(shù),2010,38(12):114-118.

[2] HADIBARATA T,KRISTANTI R A.Fate and cometabolic degradation of benzo[a]pyrene by white-rot fungusArmillariasp.F022[J].Bioresource Technolgy,2012,107:314-318.

[3] QUILLIAM R S,RANGECROFT S,EMMETT B A,et al.Is biochar a source or sink for polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) compounds in agricultural soils?[J].Global Change Biology Bioenergy,2013,5(2):96-103.

[4] CANET R,BIRNSTINGL J G,MALCOLM D G,et al.Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) by native microflora and combinations of white-rot fungi in a coal-tar contaminated soil[J].Bioresource Technolgy,2001,76(2):113-117.

[5] USEPA.Field applications of in situ remediation technologies: chemical oxidation[R].Washington,D.C.: USEPA,1998.

[6] 馮嫣,呂永龍,焦文濤,等.北京市某廢棄焦化廠不同車間土壤中多環(huán)芳烴(PAHs)的分布特征及風(fēng)險評價[J].生態(tài)毒理學(xué)報,2009,4(3):399-407.

[7] MENZIE C A,POTOEKI B B,SANTODONATO J.Exposure to carcinogenic PAHs in the environment[J].Environmental Science & Technology,1992,26(7):1278-1284.

[8] WILSON S C,JONES K C.Bioremediation of soil contaminated with polynuclear aromatic hydrocarbons (PAHs):a review[J].Environmental Pollution,1993,81(3):229-249.

[9] VAN VEEN J A,VAN OVERBEEK L S,VAN ELSAS J D.Fate and activity of microorganisms introduced into soil[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,1997,61(2):121-135.

[10] DEJONGHE W,BOON N,SEGHERS D,et al.Bioaugmentation of soils by increasing microbial richness: missing links[J].Environmental Microbiology,2001,3(10):649-657.

[11] AMBROSOLI R,PETRUZZELLI L,MINATI L J,et al.Anaerobic PAH degradation in soil by a mixed bacterial consortium under denitrifying conditions[J].Chemosphere,2005,60(9):1231-1236.

[12] 馬棟.焦化工業(yè)場地土壤的PAHs污染特征及微生物修復(fù)應(yīng)用[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[13] 劉魏魏,尹睿,林先貴,等.生物表面活性劑強化生物修復(fù)多環(huán)芳烴污染土壤的初探[J].土壤學(xué)報,2010,47(6):1118-1125.

[14] 盧曉霞,李秀利,馬杰,等.焦化廠多環(huán)芳烴污染土壤的強化微生物修復(fù)研究[J].環(huán)境科學(xué),2011,32(3):864-869.

[15] 楊旭,陳芳艷,唐玉斌.修復(fù)PAHs復(fù)合污染體系的高效菌群構(gòu)建及降解特性[J].環(huán)境工程學(xué)報,2014,8(1):360-365.

[16] 陳春云,岳珂,陳振明,等.微生物降解多環(huán)芳烴的研究進展[J].微生物學(xué)雜志,2007,27(6):100-103.

[17] 范秀榮,李廣武,沈萍.微生物學(xué)實驗[M].2版.北京:高等教育出版社,1989.

[18] HJ 478—2009,水質(zhì) 多環(huán)芳烴的測定 液液萃取和固相萃取高效液相色譜法[S].

[19] Method 3550C,Ultrasonic extraction[S].

[20] 東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京:科學(xué)出版社,2001.

[21] SAIMMAI A,RUKADEE O,ONLAMOOL T,et al.Isolation and functional characterization of a biosurfactant produced by a new and promising strain ofOleomonassagaranensisAT18[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2012,28(10):2973-2986.

[22] JORFI S,REZAEE A,MOBEH ALI G A,et al.Application of biosurfactants produced byPseudomonasaeruginosaSP4 for bioremediation of soils contaminated by pyrene[J].Soil and Sediment Contamination,2013,22(8).

[23] BEZZA F A,NKHALAMBAYAUSI CHIRWA E M.Desorption kinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) from contaminated soil and the effect of biosurfactant supplementation on the rapidly desorbing fractions[J].Biotechnology and Biotechnological Equipment,2015,29(4):680-688.

[24] ZHANG Jing,YIN Rui,LIN Xiangui,et al.Interactive effect of biosurfactant and microorganism to enhance phytoremediation for removal of aged polycyclic aromatic hydrocarbons from contaminated soils[J].Journal of Health Science,2010,56(3):257-266.

[25] CHANG J S,CHA D K,RADOSEVICH M,et al.Effects of biosurfactant-producing bacteria on biodegradation and transport of phenanthrene in subsurface soil[J].Journal of Environmental Science and Health,Part A: Toxic/Hazardous Substances and Environmental Engineering,2015,50(6):611-616.

[26] 譚文捷,李宗良,丁愛中,等.土壤和地下水中多環(huán)芳烴生物降解研究進展[J].生態(tài)環(huán)境,2007,16(4):1310-1317.

[27] 袁爽,梁成華,李鳳梅,等.多環(huán)芳烴降解菌的篩選與降解能力測定[J].生態(tài)學(xué)雜志,2011,30(2):315-319.

[28] 張銀萍,王芳,楊興倫,等.土壤中高環(huán)多環(huán)芳烴微生物降解的研究進展[J].微生物學(xué)通報,2010,37(2):280-288.