內皮微粒檢測在慢性阻塞性肺疾病診療中的應用

劉　娜 綜述，閆衛利 審校

(天津中醫藥大學第二附屬醫院　300150)

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內皮微粒檢測在慢性阻塞性肺疾病診療中的應用

劉娜 綜述，閆衛利 審校

(天津中醫藥大學第二附屬醫院300150)

內皮微粒；慢性阻塞性肺疾病；CD144；CD31；CD62E

血管內皮細胞是襯覆于血管內壁的單層扁平細胞，在保持血管內膜完整性和維持血管正常功能方面具有重要作用[1]。微粒(MPs)是細胞脫落的小囊泡，來源于血小板、紅細胞、白細胞及內皮細胞。它表達大量的細胞表面標志，富含mRNA，與多種生物學行為有關[2]。它包含了前體細胞特有的細胞膜、細胞質和細胞核結構，在大小和組成上與其他亞細胞結構如凋亡體和外染色體不同，且功能各異。幾乎所有類型的細胞都能釋放MPs。有研究表明，內皮微粒(EMPs)不僅是內皮功能紊亂的新的標志物，并被認為在炎癥、血管損傷、內皮功能障礙中發揮著重要的生物學作用。心血管、代謝、肺部疾病患者血液中EMPs水平均升高，而EMPs水平升高反映這些疾病內皮損傷嚴重程度[3]。本文首先回顧MPs的起源，重點探討EMPs與慢性阻塞性肺疾病(COPD)的關系，總結血漿EMPs的檢測方法。

1　MPs的起源

MPs存在于血漿中，直徑為0.1～1.0 μm，是富含磷脂的細胞膜顆粒。1967年，Wolf[4]發現來自活化血小板膜脫落顆粒，命名為血小板塵埃。1986年，Wagner等[5]在鐮刀形紅細胞病、遺傳性紅細胞增多癥患者中相繼發現了來源于紅細胞的MPs。1994年，Satta等[6]證實單核細胞在細菌脂多糖刺激下釋放顆粒。1999年，Combes等[7]用腫瘤壞死因子(TNF)-α刺激臍靜脈內皮細胞能使其釋放EMPs。隨后就MPs釋放機制的研究表明，細胞活化過程中，胞內鈣離子流增加，磷脂爬行酶激活，翻轉酶激活，致使膜磷脂重新分布，導致磷脂酰絲氨酸由膜內層遷移至外層，鈣離子流增加還可引起細胞收縮和細胞支架重建，細胞外形改變、出芽，這些隆起的泡狀物擠壓胞膜并脫落，脫落的細胞MPs整合了一部分細胞膜表面蛋白和其他成分，而MPs內容物多為核苷酸類如mRNA、小RNA，蛋白水解酶如金屬蛋白酶、凝血活酶等[8]。MPs在細胞生物功能調節方面的作用可概括為MPs與靶細胞表面的特殊受體結合，通過細胞的胞吞過程，將這些小分子物質和RNA轉移入靶細胞中。

2　近年研究熱點

EMPs是近年提出的反映內皮功能障礙的生物指標，表面表達磷脂酰絲氨酸和內皮細胞特征性的表面抗原，分為血小板內皮細胞黏附分子CD31、玻連蛋白CD51、鈣連蛋白CD144、黑色素瘤細胞黏附分子CD146、E選擇蛋白CD62E等5種。

2.1鈣連蛋白CD144鈣連蛋白CD144僅表達于內皮細胞，是特異性最強的標志物，其他4種EMPs在血小板、中性粒細胞、淋巴細胞、黑色素瘤細胞上也有表達。鈣連蛋白的脫落，常伴隨中性粒細胞的遷移以及血管滲透性的改變。鈣連蛋白CD144的升高，不僅表明炎癥的發生，而內皮細胞的結構也被破壞。

2.2血小板內皮細胞黏附分子CD31血小板內皮細胞黏附分子CD31有調節血小板功能，參與血管生成，以及T細胞、B細胞的激活。有實驗證明血小板內皮細胞黏附分子由肺微血管內皮細胞釋放，與過氧化氫或吸煙的刺激有關[9]。另有研究報道，90% COPD患者和60%吸煙者血小板內皮細胞黏附分子CD31表達錨定蛋白V,通過檢測錨定蛋白V，從而反映受損內皮細胞的凋亡。

2.3黑色素瘤細胞黏附分子CD146黑色素瘤細胞黏附分子CD146，參與內皮細胞的信號傳導、細胞遷移、血管生成、免疫應答[10]。

2.4E選擇蛋白CD62EE選擇蛋白CD62E在炎癥刺激后數小時被激活，招募白細胞至感染部位，反映了炎癥的進展程度。E選擇蛋白CD62E在相應細胞的靜止狀態下有一定水平的表達，在某些因素的作用下，可發生上調或下調。

2.5玻連蛋白CD51玻連蛋白CD51是整合素的α鏈，也是玻璃粘連蛋白受體的α鏈，在內皮細胞來源特異性方面低于上述4種EMPs[11]，但在白細胞的歸巢過程中起一定的作用。

3　EMPs與COPD的關系

3.1COPD的發病機制和肺功能測定的局限性COPD是一種破壞性的肺部疾病，是以不完全可逆的氣流受限為特征的疾病，氣流受限通常呈進行性發展，并與肺對有害顆粒或氣體的異常炎性反應有關。目前認為，氧化應激是引起COPD發生、發展的重要機制之一。氧化應激不僅直接損傷肺組織，還可通過激活核因子κB和絲裂原活化蛋白激酶等信號通路上調炎癥基因表達，引起肺內炎性反應，而炎性反應又可產生大量活性氧，加重肺氧化損傷，從而促進COPD病情的發生、發展[12]。氧化應激中H2O2增多引起內皮細胞凋亡和肺毛細血管內皮細胞釋放CD31+、CD144+EMPs[9]，二者升高提示COPD急性加重。而COPD急性加重又進一步導致肺毛細血管內皮細胞損傷，從而使二者血漿水平進一步升高。現階段診斷和評估COPD病情時,肺功能測定可作為一項金標準,能客觀測定氣流阻塞的程度，其中第一秒用力呼氣容積占用力肺活量百分比(FEVl/FVC)，可檢出輕度氣流受限。第一秒用力呼氣容積(FEV1)占預計值的百分比(FEV1%預計值)是中、重度氣流受限的良好指標，二者變異性小，易于操作，是目前COPD肺功能檢查的基本項目。FEVl/FVC<70%,且在應用支氣管擴張劑后FEV1%預計值<80%時,可肯定患者有氣流阻塞且不能完全逆轉。然而其有兩點局限性：首先，FEV1敏感性并不高。其次，FEV1的降低不能區分是疾病的頻繁加重還是支氣管的高反應性。再次，COPD的臨床表現和放射學變化多樣，但往往氣流受限的程度用FEV1來評價卻是相同的，導致對COPD病情的評估可能會滯后，因此用于評價COPD的新的生物學標志物有待于發現和應用。

3.2EMPs與COPD穩定期、急性加重期、肺功能損傷的關系有研究報道，與戒煙對照組相比，COPD穩定期患者，鈣連蛋白、血小板黏附分子、E選擇蛋白水平顯著升高；COPD加重期患者，E選擇蛋白水平顯著高于非頻繁發作的COPD穩定期患者[13]，表明E選擇蛋白的水平反映了內皮細胞炎癥的進展。COPD加重期，鈣連蛋白、血小板黏附分子和E選擇蛋白水平顯著升高。除此之外，COPD的加重與肺氣腫有關，而肺氣腫又與肺毛細血管的損傷密不可分。加重期鈣連蛋白、血小板黏附分子和E選擇蛋白的升高趨勢并不相同，28 d后，鈣連蛋白、血小板黏附分子仍繼續升高，表明臨床癥狀消失后內皮仍處于損傷狀態;E選擇蛋白卻逐漸降低，這與血漿纖維蛋白原的變化很相似。然而，有研究表明，COPD穩定期玻連蛋白CD51和E選擇蛋白的升高卻沒有統計學意義(P>0.05)，血小板黏附分子升高有統計學意義(P<0.05)。E選擇蛋白在COPD加重期升高顯著，穩定期變化不明顯。

上述兩份研究還探討了EMPs和肺部功能損傷的關系，結果表明，血小板黏附分子、E選擇蛋白、鈣連蛋白與FEV1占預計值的百分比呈負相關。Liu等[14]研究發現，COPD模型大鼠較健康組CD31+/CD42b-EMPs水平升高，增高的EMPs來源于肺血管內皮細胞凋亡，其用力0.3 s呼氣量/用力肺活量則下降，預示EMPs可作為COPD大鼠肺功能損害嚴重程度及肺血管內皮細胞損害及凋亡的潛在生物學指標。但增高的EMPs在COPD急性加重期中的具體作用機制尚不明確，可能與其在急性加重期引起肺血管內皮細胞功能障礙及損傷和加重炎性反應等相關。

4　EMPs的檢測

如今對EMPs的檢測應用最為廣泛的實驗技術為流式細胞術(FCM)，根據研究目的加入熒光素標記的高特異性抗體結合EMPs表面特異性抗原，如CD31+、CD144+、CD146+、CD62E+等，但多數表面抗原不是EMPs所特有表達的，且不同FCM對EMPs靈敏度不一致，還受波長限制，直徑小于0.3 μm EMPs難以被檢出[15-16]。新式流式細胞儀可分辨更小的EMPs，檢出EMPs數更高[17-18]。標本的前處理主要是采用離心法去除血細胞提取EMPs，優點是降低了底物干擾，限制了母細胞釋放新的EMPs，阻止凍融造成的細胞碎片。二次離心后得到血小板血漿能減少50%～80%的EMPs。高速離心和沖洗將EMPs從血漿中分離出來，去除未結合的抗體和其他用來檢測EMPs表面抗原的探針類物質。值得一提的是，離心方法比如轉速、時間、方式都可能影響EMPs的檢測數量，急切需要建立一套標準化的操作程序來提高檢測的可比性。

酶聯免疫吸附試驗(ELISA)也可用于EMPs的檢測，但應用受限，其原理是利用錨連蛋白V與磷脂酰絲氨酸之間的親和力，固定錨連蛋白，捕獲血漿中EMPs進行檢測。ELISA測定EMPs相對FCM雖具有對弱抗原敏感性高、不受EMPs大小限制、一次性可完成大量標本檢測等優點，但非定量，且對體積不能確定，限制了ELISA的應用，且與其結合的抗體性質易變、易受可溶性抗原干擾及不能定量等缺點。此外標本儲存時間和方式、處理方式、不同檢測方法等均會影響EMPs檢測結果，這些問題均值得探討[19-22]。

5　小　　結

本文總結了EMPs作為一個新的COPD標志物在指示疾病進展的相關研究，展望了EMPs的檢測前景，也許通過EMPs亞型的差異能夠重新對COPD的病情進行評估。

[1]Sierko E，Sokó M，Wojtukiewicz MZ.Endothelial microparticles(EMP)in physiology and pathology[J].Postepy Hig Med Dosw，2015，69(1)：925-932.

[2]辛曉敏．微粒在血栓性疾病中的作用[J]．中華檢驗醫學雜志，2014，37(3)：166-169．

[3]Takahashi T,Kubo H.The role of microparticles in chronic obstructive pulmonary disease[J].Int J Chron Obstruct Pulmon Dis,2014,9(1):303-314.

[4]Wolf P.The Nature and significance of platelet products in human plasma[J].Br J Haematol,1967,13(3):269-288.

[5]Wagner GM,Chiu DT,Yee MC,et al.Red cell vesiculation：A common membrane physiologic event[J].J Lab Clin Med,1986,108(4):315-324.

[6]Satta N,Toti F,Feugeas O,et al.Monocyte vesiculation is a possible mechanism for dissemination of membrane-associated procoagulant activities and adhesion molecules after stimulation by lipopolysaccharide[J].J Immunol,1994,153(7):3245-3255.

[7]Combes V,Simon AC,Grau GE,et al.In vitro Generation of endothelial microparticles and possible prothrombotic activity in patients with lupus anticoagulant[J].J Clin Invest,1999,104(1):93-102.

[8]Martinez MC,Tual-Chalot S,Leonetti D,et al.Microparticles:targets and tools in cardiovascular disease[J].Trends Pharmacol Sci,2011,32(11):659-665.

[9]Cocucci E,Racchetti G,Meldolesi J.Shedding microvesicles:artefacts no more[J].Trends Cell Biol,2009,19(2):43-51.

[10]Takahashi T,Kobayashi S,Fujino N,et al.Differences in the released endothelial microparticle subtypes between human pulmonary microvascular endothelial cells and aortic endothelial cells in vitro[J].Exp Lung Res,2013,39(4/5):155-161.

[11]Conway D,Schwartz MA.Lessons from the endothelial junctional mechanosensory complex[J].F1000 Biol Rep,2012,4(1):1-6.

[12]Wang Z,Yan X.CD146,a multi-functional molecule beyond adhesion[J].Cancer Lett,2013,330(2):150-162.

[13]Jimenez JJ,Jy W,Mauro LM,et al.Endothelial cells release phenotypically and quantitatively distinct microparticles in activation and apoptosis[J].Thromb Res,2003,109(4):175-180.

[14]Liu H,Ding L,Zhang Y,et al.Circulating endothelial microparticles involved in lung function decline in a rat exposed in cigarette smoke maybe from apoptotic pulmonary capillary endothelial cells[J].J Thorac Dis,2014,6(6):649-655.

[15]Thomashow MA,Shimbo D,Parikh MA,et al.Endothelial microparticles in mild chronic obstructive pulmonary disease and emphysema：The multi-ethnic study of atherosclerosis chronic obstructive pulmonary disease study[J].Am J Respir Crit Care Med,2013,188(1):60-68.

[16]Takahashi T,Kobayashi S,Fujino N,et al.Annual FEV1 changes and numbers of circulating endothelial microparticles in patients with COPD:a prospective study[J].BMJ Open,2014,4(3):4571-4588.

[17]Barnes PJ.Cellular and molecular mechanisms of chronic obstructive pulmonary disease[J].Clin Chest Med,2014,35(1):71-86.

[18]Takahashi T,Kobayashi S,Fujino N,et al.Increased circulating endothelial microparticles in COPD patients:A potential biomarker for COPD exacerbation susceptibility[J].Thorax,2012,67(12):1067-1074.

[19]Takahashi T,Suzuki S,Kubo H,et al.Impaired endothelial progenitor cell mobilization and colony-forming capacity in chronic obstructive pulmonary disease[J].Respirology,2011,16(4):680-687.

[20]Chandler WL,Yeung W,Tait JF.A new microparticle size calibration standard for use in measuring smaller microparticles using a new flow cytometer[J].J Thromb Haemost,2011,9(6):1216-1224.

[21]梁瀟，王榮麗．內皮細胞微粒在慢性阻塞性肺疾病中的研究進展[J]．現代醫藥衛生，2015，31(24)：3750-3752．

[22]Shantsila E,Montoro-García S,Gallego P,et al.Circulating microparticles:challenges and perspectives of flow cytometric assessment[J].Thrombosis and haemostasis,2014,111(6):1009-1014.

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.17.031

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1673-4130(2016)17-2437-03

2016-02-20

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