允許性高碳酸血癥對大鼠肢體缺血再灌注肺損傷的影響

衛琰，朱剛，奚棟華，周曉鳴，李立志

（上海市浦東新區人民醫院麻醉科，上海 201299)

允許性高碳酸血癥對大鼠肢體缺血再灌注肺損傷的影響

衛琰，朱剛，奚棟華，周曉鳴，李立志

（上海市浦東新區人民醫院麻醉科，上海 201299)

目的 研究允許性高碳酸血癥對大鼠肢體缺血再灌注肺損傷的影響。方法30只SD大鼠，按隨機數字法將大鼠隨機分為假手術組(SH組)、缺血再灌注組(IR組)和允許性高碳酸血癥-缺血再灌注組(PHC-IR組)，每組各10只。經腹腔全麻后對PHC-IR組實行高碳酸通氣模式（吸入10%CO2+90%空氣混合氣體)3 h，使該實驗組大鼠血氣PaCO2達到并維持于60～80 mmHg。其余兩組，吸空氣3 h。IR組和PHC-IR組建立缺血再灌注模型，分離股動脈后阻斷雙側股動脈血流4 h后(再灌前)，松夾，恢復血流后觀察4 h(再灌后)，SH組僅手術分離雙側股動脈，記錄各組大鼠機械通氣前、機械通氣后3 h、再灌注前、再灌注后的血氣分析。后處死大鼠，取左肺下葉組織，行肺濕干值(W/D)測定，光鏡下觀察肺組織形態，采用酶聯免疫吸附法測定肺組織中腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-8的水平。結果再灌注后PHC-IR組PaO2值為(70.7±6.8)mmHg，較IR組的(60.7±4.9)mmHg明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.05)；PHC-IR組大鼠肺組織W/D值為(4.86±0.53)，明顯低于IR組的(5.64±0.74)，差異有統計學意義(P＜0.05)；IR組大鼠肺毛細血管擴張充血，肺泡間質水腫，并有炎性細胞浸潤；SH組和PHC-IR組大鼠的肺泡結構較完整，肺間質肺泡腔滲出水腫較IR組減輕。PHC-IR組大鼠肺組織中TNF-α為(0.44±0.06)μg/L，IL-8為(28.3±2.6)μg/L，均明顯低于IR組的(0.83±0.18)μg/L和(33.4±3.8)μg/L，差異均有統計學意義(P＜0.05)。結論允許性高碳酸血癥可以減輕大鼠肢體缺血再灌注肺損傷，其機制可能與抑制炎性反應有關。

允許性高碳酸血癥；肢體缺血再灌注；肺損傷

外科過程，包括肢體血管的重建或者使用止血帶的手術，會使肢體處于一個長時間的缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)的過程。再灌注損傷會激發一個系統性炎癥反應，以促炎介質產物和多形核白細胞聚集為特征。在遠端肢體IR后，激活的多形核細胞因子在肺毛細血管的聚集從而引起肺損傷。允許性高碳酸血癥(permissive hypercapnia，PHC)作為一種肺通氣保護性策略，在某些肺疾病，如成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、慢性氣道阻塞和支氣管哮喘患者機械通氣中應用取得較好的效果。允許性高碳酸血癥對油酸致急性肺損傷有一定保護作用[1]，但是對肢體缺血再灌注引起的急性肺損傷是否具有一定療效，可否作為缺血預處理的一種措施尚缺乏研究。本研究通過大鼠肢體缺血再灌注損傷模型的建立，探尋PHC能否減輕肢體缺血再灌注對肺的損傷。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠30只(上海市第六人民醫院動物實驗室提供)，體質量200～300 g。

1.2 藥品試劑 白介素-8(IL-8)測定試劑盒、α腫瘤壞死因子測定試劑盒(均購于西門子公司)。

1.3 動物分組 按照隨機數字法將實驗動物隨機分為三組，假手術組(SH組)、缺血再灌注組(IR組)、允許性高碳酸血癥-缺血再灌注組(PHC-IR組)，每組各10只。

1.4 高碳酸血癥模型建立 三組大鼠10%水合氯醛3 mL/kg腹腔內注射麻醉后，置于手術臺上仰臥位固定，氣管插管，接動物呼吸機行機械通氣，呼吸頻率60次/min，潮氣量15～20 mL/kg，吸呼比(I:E)為1:2。SH組和IR組，吸空氣3 h，維持二氧化碳分壓(PaCO2)35～45 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，PHC-IR組實行高碳酸通氣模式，吸入10%CO2+90%空氣混合氣體(購于上海浦江特種氣體有限公司)3 h，使該實驗組大鼠血氣PaCO2達到并維持于60～80 mmHg。

1.5 缺血再灌注模型建立 通過手術分離雙側股動脈，假手術組進行分離不鉗夾，IR組以及PHC-IR組均采用無創血管夾鉗夾雙側股動脈4 h。IR組和PHC-IR組鉗夾4 h后進行再灌注過程：去除血管夾，恢復血流，觀察4 h。后處死各組大鼠。

1.6 檢測指標 (1)記錄各組大鼠機械通氣前、機械通氣后3 h、阻斷雙側股動脈血流4 h(再灌前)、恢復血流后4 h(再灌后)的血氣分析。(2)肺組織炎癥反應各項指標：①肺水含量：取左肺一小塊肺組織，用電子天平稱濕重，后置70℃烤箱中烘烤48 h，再用電子天平稱干重，計算肺組織濕干重比值(W/D比)，公式W/D=肺濕重/烘干后重量。②采用酶聯免疫吸附法測定肺組織中IL-8濃度和TNF-α濃度。③肺組織病理形態：左肺組織以10%中性福爾馬林浸泡固定、石蠟包埋，HE染色。

1.7 統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行統計學處理，對各組數據進行正態性檢驗及方差齊性檢驗。計量資料以均數±標準差(±s)表示，兩組之間比較采用獨立樣本t檢驗，多組之間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 動脈血氧分壓比較 三組大鼠通氣前PaO2比較差異無統計學意義(P＞0.05)，通氣3 h后IR組和PHC-IR組PaO2較SH組有降低，但是三組之間比較差異無統計學意義。再灌注前，PHC-IR組PaO2較IR組升高(P＜0.05)，與SH組差異無統計學意義(P＞0.05)；再灌注后，PHC-IR組的PaO2值比SH組有降低(P＜0.05)，但高于IR組，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠動脈血氧分壓分析(±s，mmHg)

表1 各組大鼠動脈血氧分壓分析(±s，mmHg)

注：與SH組比較，aP＜0.05；與IR組比較，bP＜0.05。

例數組別 通氣前 通氣后3 h 再灌注前 再灌注后SH組IR組PHC-IR組F值P值10 10 10 84.2±5.3 84.5+4.7 85.3±5.8 0.301 0.742 83.7±3.8 80.7±6.4 81.3±4.7 1.282 0.294 84.1±3.8 75.5±6.1 80.4±7.2b9.836 0.01 78.3±4.3 60.7±4.9 70.7±6.8ab27.275 0.000

2.2 肺組織濕重與干重比值 測定三組大鼠肺組織濕重與干重比值，SH組為(4.18±0.63)，IR組為(5.64±0.74)，PHC-IR組為(4.86±0.53)。與SH組比較，IR組，PHC-IR組肺組織W/D比值均有升高，差異有統計學意義(P＜0.05)；與IR組比較，PHC-IR組肺組織W/D比值降低，差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.3 TNF-α和IL-8測定 與SH組比較，IR組、PHC-IR組肺組織勻漿中IL-8、TNF-α均有升高，差異有統計學意義(P＜0.05)；與IR組比較，PHC-IR組肺組織勻漿中IL-8，TNF-α比值降低，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 各組大鼠肺組織勻漿中TNF-α和IL-8水平比較(±s，μg/L)

表2 各組大鼠肺組織勻漿中TNF-α和IL-8水平比較(±s，μg/L)

組別 例數IL-8TNF-α SH組IR組PHC-IR組F值P值10 10 10 11.2±2.3 33.4±3.8ab28.3±2.6a67.312 0.000 0.32±0.21 0.83±0.18ab0.44±0.06a98.542 0.000

2.4 光鏡下形態學差異 光鏡下可見假手術組的肺泡結構無破壞，肺泡壁完整、光滑，肺間質無水腫，無中性粒細胞浸潤。缺血再灌注組可見肺泡結構嚴重破壞，肺泡內以及肺泡壁大量充血，肺間隔嚴重增厚，肺泡腔和間質水腫明顯，并可見中性粒細胞浸潤。允許性高碳酸血癥-缺血再灌注組肺組織改變較IR組有減輕，見圖1。

圖1 三組大鼠肺組織光鏡下形態差異

3 討 論

缺血/再灌注肺損傷是指肺組織或其他組織器官遭受一定時間缺血后恢復血液灌流(再灌注)，肺組織損傷程度迅速增劇的病理現象[2]。外科手術，包括肢體血管的重建或者使用止血帶的手術，會使肢體處于一個長時間的缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)的過程，再灌注損傷會激發一個系統性炎癥反應，以促炎介質產物和多形核白細胞聚集為特征[3]。在遠端肢體I/R后，激活的多形核細胞因子在肺毛細血管的聚集對于肺損傷以及急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的產生起到關鍵性的作用[4]。

肢體缺血/再灌注引起肺損傷的機制包括：(1)自由基的作用：在再灌注早期大量氧自由基的產生已被認為導致組織損傷的主要機制[5]。(2)中性粒細胞的作用：分解細胞外基質，破壞血管屏障，毛細血管通透性增加，造成肺損傷和功能障礙；同時與內皮細胞(endothelial cell，EC)相互作用，釋放大量的細胞因子和炎性介質，如TNF-α、IL-1、IL-8、IL-6等，引發炎癥的級聯反應[6]。(3)致炎小分子物質的作用：致炎因子與抗炎因子平衡失調。(4)細胞凋亡的作用：使肺泡一毛細血管膜損傷，引起間質性肺水腫、肺泡水腫、肺出血導致肺臟氣體交換障礙[7]。

在本研究中，經過缺血再灌注過程后，IR組和PHC-IR組，其動脈血氧分壓較SH組均有下降，表明肢體缺血再灌注過程會對肺產生一定損傷。但是，PHC-IR組較IR組肺損傷程度減輕，其氧分壓值較IR組下降減少，表明允許性高碳酸血癥可以從一定程度上減輕肢體缺血再灌注對肺臟的損傷，但是卻不能預防損傷的產生。

允許性高碳酸血癥作為一種肺通氣的保護策略在成人某些肺疾病，如成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、慢性氣道阻塞和支氣管哮喘患者機械通氣中應用取得較好的效果，明顯降低了氣漏、肺實質損傷及脫機困難等并發癥的發生[8]。高碳酸血癥下會對機體產生一系列的影響。高碳酸性酸中毒可引起肺血管收縮，它引起的收縮作用比低氧引起的收縮作用弱，并可在肺缺血時加強肺血管收縮。同時偏酸血液再灌注對中性粒細胞活化的抑制使IL-8含量降低，從而減輕再灌注引起的炎性反應，其機制可能為：(1)偏酸血液可抑制細胞膜上Na+/H+交換蛋白的激活，從而減少中性粒細胞的活化，抑制自由基產生，減輕肺組織脂質過氧化反應；(2)減輕鈣超載；(3)偏酸血液再灌注時，可通過影響細胞膜上的脂多糖與其受體結合，終止刺激信號轉導，抑制TNF-α生成，從而減輕炎性反應[9]。本研究中，免疫酶聯法監測三組大鼠肺組織中的炎癥反應因子(TNF-α和IL-8)，發現PHC-IR組較IR組明顯下降，可見允許性高碳酸血癥這一通氣模式可以通過減輕肺臟的炎癥反應，達到肺保護的目的。

綜上所述，采取允許性高碳酸血癥這一肺通氣模式作為缺血預處理，可以有效地減輕肢體缺血再灌注對肺臟的損傷。

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Protective effects of permissive hypercapnia on lung injury induced by ischemia-reperfusion of hind limbs in rats.

WEI Yan,ZHU Gang,XI Dong-hua,ZHOU Xiao-ming,LI Li-zhi.Department of Anesthesiology,Shanghai Pudong New Area People's Hospital,Pudong 201299,Shanghai,CHINA

ObjectiveTo observe the protective effects of permissive hypercapnia on lung injury induced by ischemia-reperfusion of hind limbs in rats.MethodsA total of 30 male SD rats were randomly divided into the sham-operated group(SH group),the ischemia reperfusion group(IR group),and the permissive hypercapnia-ischemia-reperfusion group(PHC-IR group),with 10 rats in each group.PHC-IR group was treated with hypercapnic ventilation mode after general anesthesia(inhalation of 10%CO2+90%air-gas mixture)for 3 hours,so that the rats'blood Pa-CO2was maintained at 60～80 mmHg.The remaining two groups received general ventilation mode(air)for 3 hours.IR group and PHC-IR group established ischemia reperfusion injury model,isolated femoral artery,and block double side for 4 hours(before reperfusion).After blood flow was recovered and observed for 4 hours(after reperfusion),SH group only underwent surgery separation femoral artery.Artery blood gas analysis was recorded before mechanical ventilation, mechanical ventilation for 3 hours,before reperfusion,and after reperfusion.After rats were killed,the left lower lobe of the lung tissue was removed,the Wet/Dry weight ratio was determined,tumor necrosis factor(TNF)-α and interleukin (IL)-8 levels in lung tissue were measured by enzyme-linked immunosorbent assay.ResultsCompared with IR group, the PaO2value of PHC-IR group significantly increased after reperfusion((70.7±6.8)mmHg vs(60.7±4.9)mmHg,P＜0.05);W/D ratio in lung tissue of rats in the PHC-IR group was significantly reduced((4.86±0.53)vs(5.64±0.74),P＜0.05).There was dilated congestive lung capillaries,the alveolar interstitial edema and inflammatory cell infiltration in IR group;but in SH group and PHC-IR group,alveolar structure were more complete,interstitial pulmonary edema of alveolar exudate were reduced.TNF-α and IR IL-8 levels in PHC-IR group were significantly decreased than IR group ((0.44±0.06)μg/L vs(0.83±0.18)μg/L;(28.3±2.6)μg/L vs(33.4±3.8)μg/L,P＜0.05).ConclusionThe permissive hypercapnia reduced lung injury induced by ischemia-reperfusion of hind limbs in rats and its mechanism may be related to inhibiting the inflammatory response.

Permissive hypercapnia;Ischemia-reperfusion of hind limbs;Lung injury

R-332

A

1003—6350（2016）18—2934—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.18.004

2016-04-11)

上海市浦東新區人民醫院科研資助項目（編號：E12-02）

衛琰。E-mail：xiancairousi@163.com