芩蒿清熱顆粒的質量控制

吳巧娜 邸琨 徐玉萍

·藥物研究·

芩蒿清熱顆粒的質量控制

吳巧娜 邸琨 徐玉萍

目的 控制和評價芩蒿清熱顆粒的質量。方法 采用薄層色譜法(TLC)對制劑中的黃芩、枇杷葉、法半夏、蘆根進行定性鑒別，采用高效液相色譜法(HPLC)測定方中黃芩苷的含量，甲醇：水：磷酸(42∶58∶0.2)為流動相；流速：1.0 ml/min；檢測波長為278 nm。結果 TLC鑒別分離度好，專屬性強；黃芩苷的線性范圍為0.125～1.25 μg(r=0.9999)，平均加樣回收率為101.33%，RSD為1.53%。結論 該方法簡便、準確、重復性好，可對芩蒿清熱顆粒的質量進行有效控制。

芩蒿清熱顆粒；薄層色譜法；高效液相色譜法；黃芩苷

芩蒿清熱顆粒是由黃芩、青蒿、枇杷葉、苦杏仁、法半夏、葶藶子、蘆根等中藥制成的復方制劑，由臨床經驗方加減而來，具有清熱燥濕、化痰止咳的功效，主治肺熱咳嗽，痰涎壅盛，氣喘，咽干，能有效降低患者的咳嗽強度，抑制痰液的生成，明顯改善患者的臨床癥狀。前期考察了該制劑的制備工藝，為保證芩蒿清熱顆粒產品的均一性和穩定性，從定性和定量兩方面對其質量進行控制。

1 儀器與試藥

安捷倫-1100高效液相色譜儀，KH3200型超聲波清洗器(220 V，50 Hz)，Sartorius BP211D電子分析天平，WFH-203B暗箱式三用紫外分析儀。黃芩苷對照品(批號：110715-200514)；黃芩素對照品(批號：11595-200905)；漢黃芩素對照品(批號：111514-200403)；黃芩對照藥材(批號：120955-200607)；熊果酸對照品(批號：110742-200516)；枇杷葉對照藥材(批號：121261-200502)；甘草次酸對照品(批號：110723-200411)；蘆根對照藥材(批號：121107-201003)；所用對照品、對照藥材均購于中國藥品生物制品檢定所。芩蒿清熱顆粒(批號：140113，140114，140115)為醫院自制；硅膠G，硅膠GF254，聚酰胺薄膜，流動相及其他試劑均符合2010版我國藥典標準。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 黃芩薄層色譜鑒別[1-3]:取本品顆粒10 g，加水20 ml溶解，用鹽酸調pH值為1～2，離心，先取上清液加三氯甲烷萃取2次，每次20 ml，再取沉淀，用10 ml熱水溶解，加10 ml乙酸乙酯萃取2次，分別將三氯甲烷和乙酸乙酯層蒸干，殘渣加甲醇溶解后合并，定容到2 ml作為供試品溶液。陰性樣品溶液按相同方法制備。取黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素三種對照品各2 mg，分別加甲醇2 ml、4 ml、4 ml使溶解，作為對照品溶液。取黃芩對照藥材粗粉加甲醇制成濃度為1 mg/ml 的對照藥材溶液。吸取上述6種溶液，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶3∶1∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外燈(365 nm)下檢視。見圖1。

圖1 黃芩薄層鑒別色譜圖

注：1.黃芩苷對照品;2.黃芩素對照品;3.漢黃芩素對照品;4.黃芩對照藥材;5～7.不同批號樣品;8.陰性樣品

2.1.2 枇杷葉薄層色譜鑒別[1,4]:取本品顆粒2 g，研磨后置具塞錐形瓶中，加20 ml乙醚放置24 h，過濾，濾液蒸干，殘渣加乙醚5 ml溶解，作為供試品溶液。陰性樣品溶液，枇杷葉對照藥材溶液按相同方法制備。另取熊果酸對照品3 mg，加甲醇3 ml使溶解，作為對照品溶液。吸取上述4種溶液，分別點于同一硅膠G板上，以甲苯-丙酮(5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%的硫酸乙醇溶液，在105℃下加熱使顯色清晰。日光下檢視。見圖2。

圖2 枇杷葉薄層鑒別色譜圖

注：1.熊果酸對照品;2.枇杷葉對照藥材;3.漢黃芩素對照品;4.黃芩對照藥材

2.1.3 法半夏薄層色譜鑒別[1]:取本品顆粒5 g，加鹽酸5 ml，三氯甲烷30 ml，超聲提取50 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加1 ml的無水乙醇溶解，作為供試品溶液。陰性樣品溶液按相同方法制備。甘草次酸對照品溶液加無水乙醇制成，含量為1 mg/ml。吸取上述3種溶液，分別點于同一硅膠GF254板上，以石油醚(30～60℃)-乙酸乙酯-丙酮-甲酸(30∶6∶5∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外燈(254 nm)下檢視。見圖3。

圖3 法半夏薄層鑒別色譜圖

注：1.甘草次酸對照品；2～4.不同批號樣品；5.陰性樣品

2.1.4 蘆根薄層色譜鑒別[1]:取本品顆粒5 g，加三氯甲烷20 ml，超聲處理25 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 ml溶解，作為供試品溶液。陰性樣品溶液，蘆根對照藥材溶液按相同方法制備[5]。吸取上述3種溶液，分別點于同一硅膠G板上，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干。在紫外燈(365 nm)下檢視。見圖4。

圖4 蘆根薄層鑒別色譜圖

注：1～2.蘆根對照藥材；3.陰性樣品；4-6.不同批號樣品

薄層色譜圖顯示，在與對照藥材、對照品色譜的相應位置處，黃芩、枇杷葉、法半夏、蘆根四種藥材的特征斑點均被檢出，陰性樣品無干擾，可以列入產品的質量控制標準。

2.2 黃芩苷的含量測定[5-8]

2.2.1 色譜條件:色譜柱：Hypersil-ODS C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，甲醇：水：磷酸(42∶58∶0.2)為流動相；檢測波長為278 nm；流速：1.0 ml/min。

2.2.2 對照品溶液的制備:精密稱取60℃減壓干燥6 h 的黃芩苷對照品3.125 mg，置25 ml的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，其濃度為0.125 mg/ml。

2.2.3 供試品溶液的制備:取芩蒿清熱顆粒2 g，精密稱定，置100 ml具塞錐形瓶中，加70%乙醇40 ml，超聲提取30 min，濾過，濾液置100 ml量瓶中，用少量70%乙醇洗滌容器和殘渣并定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.4 陰性試驗:按供試品溶液的制備方法制成缺黃芩的陰性對照品溶液。進樣，記錄色譜圖，結果顯示黃芩苷的色譜峰與其他組分的色譜峰達到基線分離，陰性對照無干擾。見圖5。

2.2.5 回歸方程的測定:精密吸取黃芩苷對照品溶液 1 μl、2 μl、3 μl、5 μl、7 μl、10 μl 分別注入高效液相色譜儀。以峰面積為縱坐標，黃芩苷進樣量為橫坐標，得回歸方程Y=2359.3X-1.9267，r=0.9999，表明黃芩苷在0.125～1.25 μg范圍內具備良好的線性關系。見表1。

2.2.6 精密度考察:精密吸取對照品溶液5 ml，置10 ml 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，取稀釋后的對照

A黃芩苷對照品B供試品C陰性對照品

圖5 黃芩苷的HPLC色譜圖 表1 線性關系考察結果

品溶液10 μl，連續進樣5次，結果表明該方法的精密度良好，黃芩苷峰面積的相對標準偏差(RSD)為1.01%。見表2。

表2 精密度試驗

2.2.7 重復性試驗:取同一批供試品5份，分別制備供試品溶液并進樣測定，黃芩苷的平均含量為9.40 mg/g,RSD為0.89%，重復性良好。見表3。

表3 重復性試驗

2.2.8 穩定性試驗:取同一供試品溶液，于0 h、2 h 、4 h、 6 h、12 h分別進樣10 μl，測定黃芩苷的峰面積，其RSD為1.58%，結果表明供試品溶液在12 h內穩定。見表4。

表4 穩定性試驗

2.2.9 加樣回收試驗:取已知含量的同一批號樣品(黃芩苷含量為9.42 mg/g)6份，每份約0.2 g，精密稱定，置100 ml具塞錐形瓶中，分別精密加入5 ml黃芩苷對照品溶液(0.125 mg/ml)，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，測定黃芩苷的含量，計算回收率。結果表明，黃芩苷平均回收率為101.33%，RSD為1.53%，表明本法加樣回收率良好。見表5。

表5 加樣回收試驗

2.2.10 樣品含量測定:取三批樣品，每批2份，每份約2 g。精密稱定，置100 ml具塞錐形瓶中，按供試品溶液制備方法制成供試品溶液，以上述色譜條件測定，根據樣品測定結果，暫定芩蒿清熱顆粒中黃芩苷的含量不低于9 mg/g。見表6。

表6 樣品含量測定 mg/g

3 討論

芩蒿清熱顆粒原方為傳統湯劑，臨床療效確切，但服用不便，制成顆粒后避免了復雜的煎煮，對其質量標準進行研究，為日后向醫院成方制劑的轉化奠定了基礎。

在含量測定實驗過程中，供試品溶液的提取溶劑采用了70%乙醇和50%乙醇進行對比，結果顯示前者提取效率更高；提取方法分別采用超聲提取和回流提取，結果顯示前者提取30 min比后者提取1 h測得的黃芩苷的含量高，且超聲提取法操作簡便，故選擇超聲提取。提取時間考察了15 min、30 min、60 min，結果表明：超聲提取60 min黃芩苷的含量最高，但是其含量在超聲30 min與超聲60 min的對比中相差很小，故選擇超聲30 min。

研究初始，對處方中的黃芩、青蒿、枇杷葉、苦杏仁、法半夏、葶藶子、蘆根分別進行了薄層色譜鑒別，但是青蒿、苦杏仁、葶藶子的指標性成分的斑點與處方中其他成分的斑點重合嚴重，參考相關文獻，幾次調整展開系統的比例及更換展開溶劑均不能得到有效分離，可能與藥材的提取方法有關，需進一步試驗驗證，故以上三味飲片的薄層鑒別暫不列入質量標準中。

由于本方藥物種類較多，所含成分復雜，在蘆根的薄層鑒別前期展開距離較短時，檢測斑點之間重疊較嚴重，當延長展開時間，增加展距時，取得了理想的展開效果。

在定性鑒別過程中，對黃芩、枇杷葉、法半夏、蘆根的展開系統進行了篩選[9,10]，枇杷葉最初展開系統為三氯甲烷—甲醇—無水乙酸(15∶1∶0.2),但展開后色譜中斑點拖尾嚴重，分離效果不佳；法半夏的定性鑒別在展開劑石油醚(30℃～60℃)-苯-乙酸乙酯-冰醋酸(5∶10∶4∶0.5)中取得較滿意效果，但苯的用量及毒性較大；蘆根的薄層鑒別過程中，初始階段遴選展開劑為環己烷—乙酸乙酯(20∶4)，但需噴磷鉬酸試劑顯色后再加熱，操作繁瑣，均棄用。四種藥材薄層鑒別的分離效果以2010版藥典收錄的展開系統為最佳，值得提出的是，黃芩在另一展開系統——甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)的薄層鑒別同樣取得滿意效果。

黃芩作為芩蒿清熱顆粒制劑的君藥，具有清熱燥濕，涼血安胎，解毒的功效，所以選擇黃芩苷為含量測定的指標。查閱文獻資料，在含量測定過程中，黃芩苷的檢測波長范圍275～280 nm[11,12]，經初期試驗供試品黃芩苷在278 nm出現最大吸收峰，所以選擇278 nm為檢測波長，流動相曾選用藥典收錄的甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)，但色譜峰分離效果不佳，經過調整試劑含量比例，確定以甲醇-水-磷酸(42∶58∶0.2)為流動相，黃芩苷的色譜峰得到很好分離。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2017.11.040

050011 河北省石家莊市第三醫院藥劑科(吳巧娜、邸琨)，婦科(徐玉萍)

R 927.2

A

1002-7386(2017)11-1736-04

2016-11-16)