基于線粒體COⅠ基因序列的DNA條形碼在中國(guó)南海緋鯉屬魚(yú)類鑒定中的應(yīng)用

宮亞運(yùn)，章 群，曹 艷，呂金磊，楊喜書(shū)

（暨南大學(xué)水生生物研究中心，廣州 510632）

基于線粒體COⅠ基因序列的DNA條形碼在中國(guó)南海緋鯉屬魚(yú)類鑒定中的應(yīng)用

宮亞運(yùn)，章 群，曹 艷，呂金磊，楊喜書(shū)

（暨南大學(xué)水生生物研究中心，廣州 510632）

為探討COⅠ基因作為DNA條形碼對(duì)緋鯉屬（Upeneus）魚(yú)類鑒定的有效性，明確物種的分類地位，通過(guò)COⅠ基因5＇端652 bp序列研究中國(guó)南海緋鯉屬的黑斑緋鯉（Upeneus tragula）、馬六甲緋鯉（Upeneus moluccensis）、縱帶緋鯉（Upeneus subvittatus）、黃帶緋鯉（Upeneus sulphureus）、呂宋緋鯉（Upeneus luzonius）以及條尾緋鯉（Upeneus bensasi）6個(gè)種56 ind標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼序列的種內(nèi)種間遺傳距離，并構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)。研究表明：所測(cè)樣品的堿基組成為T：29.2%，C：29.6%，A：21.4%，G：19.8%，A＋T含量（50.6%）略高于G＋C含量（49.4%），轉(zhuǎn)換/顛換率為3.08。6種緋鯉屬魚(yú)類組成5個(gè)自展支持率為100%的分支，其中黑斑緋鯉和馬六甲緋鯉混雜分布于同一分支上，其余4種緋鯉獨(dú)自成支；分支間平均遺傳距離10.10%（8.60%～12.40%），是分支內(nèi)平均遺傳距離0.18%（0.00%～0.30%）的56倍。縱帶緋鯉、黃帶緋鯉、呂宋緋鯉、條尾緋鯉種間平均遺傳距離為10.70%（8.80%～12.40%），約為這4個(gè)種種內(nèi)平均遺傳距離0.125%（0.00%～0.20%）的85倍，種間遺傳距離大于種內(nèi)遺傳距離的10倍以上，確定了它們的物種有效性。黑斑緋鯉和馬六甲緋鯉種內(nèi)遺傳距離分別為0.40%和0.20%，與其它4種緋鯉為同一水平；但種間遺傳距離僅為0.30%，屬于一般物種的種內(nèi)遺傳距離范圍，因此推測(cè)二者或?yàn)橥晃锓N，但還需從形態(tài)學(xué)和基因組序列分析等方面加以進(jìn)一步確證，其是否受到種間雜交和近期輻射進(jìn)化的影響也需要今后更多的研究。標(biāo)準(zhǔn)的DNA條形碼雖然能夠有效地區(qū)分中國(guó)南海緋鯉屬魚(yú)類中的縱帶緋鯉、黃帶緋鯉、呂宋緋鯉和條尾緋鯉，但DNA條形碼對(duì)黑斑緋鯉和馬六甲緋鯉的鑒定與形態(tài)學(xué)的鑒定結(jié)果不一致，表明在物種鑒定時(shí)，母系遺傳的線粒體COⅠ基因有時(shí)需要結(jié)合其它核基因分子標(biāo)記或生態(tài)調(diào)查資料加以輔助。

緋鯉屬；DNA條形碼；COⅠ基因；中國(guó)南海

準(zhǔn)確的物種鑒定是開(kāi)展生理生態(tài)研究和資源開(kāi)發(fā)利用的前提與基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的魚(yú)類分類主要依據(jù)外部形態(tài)特征，并結(jié)合比較解剖學(xué)特性和生態(tài)習(xí)性來(lái)確定，雖能區(qū)分大部分魚(yú)類，但通常比較依賴鑒定者的個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，且很多魚(yú)類的條紋、斑點(diǎn)、體色等外部形態(tài)易受外界環(huán)境及發(fā)育階段的影響而產(chǎn)生變化，鑒定時(shí)常會(huì)出現(xiàn)爭(zhēng)議和錯(cuò)誤。為此HEBERT等[1－2]提出了DNA條形碼（DNA barcoding）的概念，即通過(guò)分析一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的目標(biāo)基因的DNA序列對(duì)物種進(jìn)行鑒定，對(duì)動(dòng)物界除刺胞動(dòng)物門外的所有11個(gè)門13 320個(gè)物種的研究表明，線粒體 COⅠ基因（細(xì)胞色素氧化酶亞基I）靠近5′端的一段序列能夠有效鑒定動(dòng)物界物種，其序列間的差異能夠很好地鑒別所研究的物種。隨著HEBERT等[3]和WARD等[4]分別在北美260種鳥(niǎo)類和澳大利亞207種魚(yú)類中分子鑒定的成功，COⅠ基因5′端約652 bp的序列憑借其快速簡(jiǎn)單高效的特點(diǎn)，已成為動(dòng)物界物種鑒定的首選DNA條形碼，目前已經(jīng)成功應(yīng)用于鰈形目、鯉形目及裸胸鱔屬等魚(yú)類的物種鑒定中[5－7]，在植物、微生物以及生物多樣性調(diào)查和保護(hù)等領(lǐng)域也發(fā)揮著重要作用[8]。

緋鯉屬（Upeneus）魚(yú)類隸屬輻鰭魚(yú)綱（Actinopterygii）鱸形目（Perciformes）羊魚(yú)科（Mullidae）[9]，廣泛分布于印度洋、太平洋等溫?zé)岷^(qū)沿岸淺海區(qū)域[10]。羊魚(yú)科魚(yú)類的突出特點(diǎn)是它們頦部具有一對(duì)長(zhǎng)須，有兩個(gè)獨(dú)立的背鰭；其中緋鯉屬的典型特征是犁骨和顎骨上有絨毛狀齒[9]。據(jù)報(bào)道，目前世界范圍內(nèi)分布的緋鯉屬魚(yú)類共有30種[11]，中國(guó)分布有其中的8種[10]，其中南海分布有黑斑緋鯉（Upeneus tragula）、馬六甲緋鯉（Upeneus moluccensis）、縱帶緋鯉（Upeneus subvittatus）、黃帶緋鯉（Upeneus sulphureus）、呂宋緋鯉（Upeneus luzonius）、條尾緋鯉（Upeneus bensasi）6種[9]。緋鯉屬魚(yú)類肉質(zhì)鮮美，是海洋漁業(yè)的重點(diǎn)捕撈對(duì)象[12]，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[9]；由于目前南海魚(yú)類資源多數(shù)呈現(xiàn)逐年衰退的局面[13]，為避免緋鯉屬魚(yú)類資源的衰竭，有必要對(duì)其現(xiàn)有的漁業(yè)資源進(jìn)行合理的保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用，而物種的準(zhǔn)確鑒定是開(kāi)展其后續(xù)保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用研究的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的緋鯉屬魚(yú)類分類方法主要依據(jù)體色和斑紋等，但緋鯉屬魚(yú)類被薄櫛鱗，鱗片極易脫落[9]，其外部形態(tài)易受到破壞；同時(shí)，由于生境和發(fā)育階段的不同，不同個(gè)體的色彩斑紋差異也較大[10]，這就給緋鯉屬的分類鑒定帶來(lái)了很大困難；此外，不同鑒定者鑒定往往會(huì)有不同的結(jié)果，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)同物異名等情況[10，14]。而DNA條形碼技術(shù)采用分子手段對(duì)物種進(jìn)行鑒定，不依賴個(gè)體形態(tài)特征，不受個(gè)體發(fā)育階段的影響，并能發(fā)掘潛在的隱存種等，擁有許多傳統(tǒng)鑒定方法無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，其在很多物種鑒定中的準(zhǔn)確性和有效性也已被廣泛證實(shí)。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)緋鯉屬魚(yú)類的研究多集中在對(duì)其形態(tài)指標(biāo)、生態(tài)學(xué)方面以及資源狀況的研究等[15－17]；分子方面除LAKRA等[18]對(duì)印度洋海洋魚(yú)類的DNA條形碼研究中涉及到的緋鯉屬中斑尾緋鯉（Upeneus vittatus）3 ind和黃帶緋鯉4 ind外，未見(jiàn)用DNA條形碼技術(shù)對(duì)中國(guó)南海緋鯉屬魚(yú)類進(jìn)行研究的報(bào)道。本研究采用DNA條形碼技術(shù)對(duì)中國(guó)南海緋鯉屬魚(yú)類進(jìn)行鑒定，探究COⅠ基因序列作為區(qū)分南海緋鯉屬魚(yú)類物種的有效性，以期明確中國(guó)南海緋鯉屬魚(yú)類的分類地位，并探尋可能存在的隱存種，為其種質(zhì)資源的保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用提供參考資料，同時(shí)也為緋鯉屬魚(yú)類DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行補(bǔ)充。

1 材料與方法

根據(jù)《南海魚(yú)類志》[9]對(duì)采自11個(gè)地點(diǎn)共56 ind在95%乙醇中保存良好的標(biāo)本進(jìn)行鑒定，共得到6個(gè)種，其中黑斑緋鯉16 ind、馬六甲緋鯉6 ind、縱帶緋鯉8 ind、黃帶緋鯉12 ind、呂宋緋鯉4 ind、條尾緋鯉10 ind。樣品具體采樣地點(diǎn)和種類見(jiàn)表1。

取背部肌肉晾干后提取總DNA，提取方法參考高鹽法[19]。設(shè)計(jì)PCR引物：CX1F2：5′-ACCTGTGGCAATCACACGCTGAT，TestCXR1a：5′-ATGTGRTTGGCTTGAAAC。PCR后，將經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶清晰的PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因有限公司，切膠純化后在ABI-3730自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序。測(cè)定的序列通過(guò)MEGA 6.0[20]軟件進(jìn)行人工校對(duì)，計(jì)算堿基組成、變異位點(diǎn)、轉(zhuǎn)換與顛換的比值以及基于Kimura 2-parameter（K2P）模型的種內(nèi)和種間遺傳距離，構(gòu)建鄰接樹(shù)，經(jīng)1 000次重復(fù)抽樣（bootstraps）檢測(cè)分支置信度。

2 結(jié)果與分析

2.1 COⅠ基因片段序列特征

在擴(kuò)增到的652 bp線粒體COⅠ基因5′端序列中，沒(méi)有出現(xiàn)堿基插入和缺失，其中多態(tài)位點(diǎn)132個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)121個(gè)。T、C、A、G平均含量分別是29.2%、29.6%、21.4%、19.8%，A＋T含量（50.6%）略高于C＋G含量（49.4%），與其它硬骨魚(yú)類線粒體COⅠ基因堿基組成的基本特征一致[4]。轉(zhuǎn)換與顛換比（R）為3.08，表明COⅠ基因序列的突變未達(dá)到飽和，適合遺傳分析[21]。

2.2 鄰接樹(shù)和種內(nèi)種間K2P遺傳距離

在鄰接樹(shù)上，6種緋鯉屬魚(yú)類組成了5個(gè)支持率為100%的支系，分支內(nèi)與分支間平均遺傳距離分別為0.18%（0.00%～0.30%）、10.10%（8.60%～12.40%），分支間平均遺傳距離是分支內(nèi)平均遺傳距離的56倍；其中分支2和分支5間遺傳距離最大（12.40%），分支1與分支2以及分支1與分支3的遺傳距離最小（8.60%）。在鄰接樹(shù)上黑斑緋鯉和馬六甲緋鯉互相混雜，共同位于支系1，其它4種緋鯉獨(dú)自成支（圖1）。

表1 研究所用樣品及采集地Tab.1 Specimens and sampling information in the present study

圖1 COⅠ基因基于K 2P模型構(gòu)建的NJ樹(shù)Fig.1 NJ tree based on COⅠgene using K2Pmodel

基于K2P模型的種內(nèi)種間遺傳距離見(jiàn)表2。種內(nèi)遺傳距離最大的為黑斑緋鯉（0.40%），最小的為呂宋緋鯉（0.00%），平均為0.18%；種間遺傳距離最大的是縱帶緋鯉與條尾緋鯉（12.40%），最小的是黑斑緋鯉與馬六甲緋鯉（0.30%），平均為9.26%；種間平均遺傳距離約為種內(nèi)平均遺傳距離的51倍。單獨(dú)分析獨(dú)立成支的4種緋鯉時(shí)，種內(nèi)遺傳距離最大的為縱帶緋鯉和條尾緋鯉（均為0.20%），最小的為呂宋緋鯉（0.00%），平均為0.125%；種間遺傳距離最大的仍為縱帶緋鯉和條尾緋鯉（12.40%），最小的是縱帶緋鯉和黃帶緋鯉（8.80%），平均為10.70%，種間平均遺傳距離約為種內(nèi)平均遺傳距離的85倍。

3 討論

3.1 COⅠ基因?qū)δ虾＞p鯉屬魚(yú)類的鑒定

利用COⅠ基因序列進(jìn)行物種鑒定的主要標(biāo)準(zhǔn)在于種間遺傳距離遠(yuǎn)大于種內(nèi)遺傳距離（約10倍以上）[1]。除腔腸動(dòng)物門（Cnidaria）外，大部分動(dòng)物種內(nèi)遺傳距離小于1%，很少大于2%，2%是DNA條形碼研究中的物種劃分參考值[2]。本文6種魚(yú)類種內(nèi)遺傳距離（0.00%～0.40%）均小于1%，符合種內(nèi)遺傳距離標(biāo)準(zhǔn)，其中獨(dú)自成支的縱帶緋鯉、黃帶緋鯉、呂宋緋鯉、條尾緋鯉相互間遺傳距離（8.80%～12.40%）都顯著大于種間2%的遺傳差異界限[2]，且均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于它們種內(nèi)遺傳距離的10倍以上，DNA條形碼對(duì)這4種魚(yú)類進(jìn)行了有效的區(qū)分。黑斑緋鯉和馬六甲緋鯉混雜分布在鄰接樹(shù)的同一個(gè)分支上，種間遺傳距離（0.30%）在一般物種種內(nèi)范圍（≤2%），但在形態(tài)上，黑斑緋鯉自吻尖經(jīng)眼到尾鰭基有一黑色縱帶，第一背鰭頂端黑色；馬六甲緋鯉體側(cè)為金黃色縱帶，且背鰭尾鰭上葉均有黃棕色條紋[9]，二者有較明顯的區(qū)別。對(duì)于這種情況，推測(cè)原因如下：一方面，很多魚(yú)類在不同的發(fā)育階段斑紋、色澤等都有顯著差異[22－23]，如鯛科黑鯛（Sparus macrocephalus）、切氏黑棘鯛（Sparus swinhonisczerskii）體側(cè)有6～7條明顯的橫帶，而黑棘鯛（Acanthopagrus schlegelii）體側(cè)無(wú)橫帶，與前二者外部形態(tài)上存在差異，但AKAZAKI[24]研究發(fā)現(xiàn)黑棘鯛為唯一的有效種，黑鯛和切氏黑棘鯛均為黑棘鯛的幼魚(yú)；吳仁協(xié)等[25]在研究外部無(wú)橫帶黑棘鯛（A.schlegeliischlegelii）和有橫帶黑棘鯛（A.schlegeliiczerkii）時(shí)，發(fā)現(xiàn)二者COⅠ和控制區(qū)基因序列的平均遺傳距離僅分別為0.15%和0.51%，且并未形成單系群，認(rèn)為二者是同一物種的不同形態(tài)型。筆者推測(cè)黑斑緋鯉和馬六甲緋鯉有可能與上述情況類似，是同一物種的不同形態(tài)型。或二者不是同一物種，可能情況如下：1）存在種間雜交現(xiàn)象。本文馬六甲緋鯉和部分黑斑緋鯉均采自廣東陽(yáng)江和廣西合浦，同屬的近緣物種處于相同的地點(diǎn)和相似的生活環(huán)境時(shí)，由于缺乏有效的隔離機(jī)制，使得相互間的基因滲透幾率升高，可能出現(xiàn)雜交現(xiàn)象[26]。黑斑緋鯉和馬六甲緋鯉體側(cè)均具縱帶，僅有顏色方面的差別，雜交后代可能在形態(tài)上更多的表現(xiàn)為縱帶顏色不同的中間形態(tài)或者趨向于親本中的一種。但由于線粒體DNA是核外遺傳物質(zhì)，呈母系遺傳（maternal inheritance）方式，后代線粒體DNA幾乎全部來(lái)自母本，因而可能會(huì)出現(xiàn)分子與形態(tài)鑒定結(jié)果不一致的情況。2）近期輻射進(jìn)化的影響。GOVINDARAJU等[27]對(duì)印度洋沿岸7種石斑魚(yú)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）研究發(fā)現(xiàn)，點(diǎn)帶石斑魚(yú)（Epinephelus coioides）、巨石斑魚(yú)（Epinephelus tauvina）和黑帶石斑魚(yú)（Epinephelus malabaricus）間遺傳距離很近，但從斑點(diǎn)、體色方面差異可以區(qū)分，這與本文中黑斑緋鯉和馬六甲緋鯉的情況十分類似；另外SHEARER等[28]對(duì)30個(gè)加勒比海珊瑚礁物種的研究發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)COⅠ條形碼序列長(zhǎng)度較短且進(jìn)化速度較慢，而近期進(jìn)化形成的物種種間分化不足，導(dǎo)致種間和種內(nèi)的遺傳距離往往相差不大，對(duì)近期進(jìn)化形成的物種經(jīng)常難以徹底區(qū)分。因此，結(jié)合上述報(bào)道，也不排除二者是近期輻射進(jìn)化形成的可能。

表2 緋鯉屬魚(yú)類基于K 2P模型的種間（對(duì)角線下）和種內(nèi)（對(duì)角線）遺傳距離Tab.2 Inter-species（below diagonal）and intra-species（diagonal）genetic distance based on K 2P model of Upeneus

3.2 小結(jié)與展望

綜上所述，線粒體COⅠ基因能夠作為DNA條形碼有效地鑒定區(qū)分中國(guó)南海緋鯉屬魚(yú)類中的縱帶緋鯉、黃帶緋鯉、呂宋緋鯉、條尾緋鯉。由于DNA條形碼對(duì)物種的鑒定不依賴個(gè)體形態(tài)，不受發(fā)育階段影響，今后可被廣泛應(yīng)用于這幾種緋鯉屬魚(yú)卵、仔稚魚(yú)的鑒定工作，為海洋漁業(yè)早期調(diào)查提供資料，同時(shí)也能用來(lái)對(duì)緋鯉屬魚(yú)類形態(tài)學(xué)分類系統(tǒng)進(jìn)行補(bǔ)充和修訂。由于采樣的限制，本文所分析樣本量仍有不足，得到的結(jié)果可能不夠全面，同時(shí)黑斑緋鯉和馬六甲緋鯉的分類地位仍未明確，考慮在今后的工作中，擴(kuò)大采樣的地理范圍，增加分析樣品的數(shù)量，進(jìn)行詳細(xì)形態(tài)測(cè)量和傳統(tǒng)漁業(yè)生物學(xué)調(diào)查，選取線粒體中進(jìn)化速度更快的區(qū)域如控制區(qū)等，并結(jié)合核基因等信息研究是否存在生殖或遺傳隔離等情況，以更好地明確它們的分類地位和遺傳背景，為種質(zhì)資源的保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用提供參考資料。

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Application of Mitochondrial Cytochrome Oxidase Subunit I sequence in DNA barcoding Upeneus in the South China Sea

GONG Ya-yun，ZHANG Qun，CAO Yan，LV Jin-lei，YANG Xi-shu
（Institute of Hydrobiology，Jinan University，Guangzhou510632，China）

To test the role of652 bp segments of mtDNA cytochrome oxidase subunit I gene as DNA barcoding in identifyingUpeneusspecies，reliably determining species status and constructing a reference sequence library，specimens collected in the South China Sea were morphologically identified，the intra-species and inter-species genetic distances of the genusUpeneuswere calculated，and phylogenetic trees were reconstructed.DNA barcoding from 56 specimens representing 6 species of genusUpeneusrevealed that the nucleotide compositions were calculated as T＝29.2%，C＝29.6%，A＝21.4%，G＝19.8%，A＋T（50.6%）was slightly higher than C＋G（49.4%），the average value of transition/transversion ratios was 3.08.In the NJ tree 6 species exhibited 5 discrete clades with 100%bootstrap supports，of whichUpeneus tragulaandUpeneusmoluccensiswere intertwined in the same clade，and the remaining 4 species formed 4 independent clades，the average genetic distances among clades[10.1%（8.6%－12.4%）]were 56 times thatwithin clades[0.18%（0.0%－0.3%）].Inter-species distances amongUpeneus subvittatus，Upeneus sulphureus，Upeneus luzonius，andUpeneus bensasi[10.7（8.8%－12.4%）]were 85 times that of the intraspecies[0.125%（0.0%－0.2%）]，the inter-species distances were 10 times greater than that of intraspecies divergences（the＂10x rule＂），which confirmed their species status.Although intra-species genetic distances ofU.tragulaandU.moluccensiswere 0.4%and 0.2%respectively，which were similar to the other 4 congeneric species，the genetic distances betweenU.tragulaandU.moluccensiswere only 0.3%，which fell within the scope of most intra-species distances，suggesting that they might be the same species，but it needs to be confirmed by morphological and genomic sequence analysis，and interspecific hybridization or recent evolutionary radiation also should be excluded in further studies.Although DNA barcoding permitted the discrimination of66.7%（4/6）Upeneusspecies，demonstrating the utility of barcoding for regional species identification，the inconsistence of DNA barcoding and morphological identification ofU.tragulaandU.moluccensisnecessitates the worth of combination ofmore detailed morphological examination and ecological investigation，and sequence information from nuclear genes and/or fast-evolving mitochondrial DNA genes.

Upeneus；DNA barcoding；Cytochrome Oxidase Subunit1；the South China Sea

Q 349

A

1004－2490（2016）02－0113－07

2015－10－22

國(guó)家自然科學(xué)基金（41071034）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（21613105）；歐盟Erasmus Mundus TECHNO I博士后教育交流項(xiàng)目

宮亞運(yùn)（1990－），男，山東即墨人，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿由鷳B(tài)學(xué)。E-mail：gyy19901005＠163.com

章 群，副研究員。Tel：13431042736，E-mail：tqzhang＠jnu.edu.cn