非編碼RNA與肝細胞癌的研究進展

廖文英　康潔　陳育芬　劉朝富

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非編碼RNA與肝細胞癌的研究進展

廖文英康潔陳育芬劉朝富

521000廣東潮州解放軍第一八八醫院腫瘤科

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是臨床上的常見惡性腫瘤之一，也是第三大導致癌癥病死的原因[1]。由于缺少有效的治療措施，晚期HCC常常導致患者快速死亡。與其它多種惡性腫瘤相似，HCC的發生中存在著多種基因網絡及信號通路的調控異常。這些改變的基因包括可編碼蛋白質的基因及非編碼RNA(noncoding RNA，ncRNA)。近年來，隨著對微小RNA(micro-RNA，miRNA)研究的深入，逐漸認識到包括miRNA在內的ncRNA在HCC的發生、發展及轉移中扮演著十分重要的角色。ncRNA是一種不翻譯為蛋白質的功能性RNA，人類的基因組中只有不足2%的基因序列最終翻譯為功能性蛋白質，其他很大比例是轉錄為ncRNA，并通過多種途徑直接發揮生物學作用[2]。ncRNA具有多種類型，且不同類型的轉錄譜是存在著巨大差異的。同時，人基因組編碼的ncRNA數量仍屬未知，也不斷有研究發現全新的功能性ncRNA[3]。長鏈非編碼RNA (long noncoding RNA，lncRNA)是大小超過200個核苷酸長度的ncRNA。雖然與microRNA相比其生物學功能尚不明確，但是越來越多的研究顯示lncRNA可通過多種機制來干預相關基因的表達。在HCC中，ncRNA作為致病、診斷、預后及治療相關的研究靶點也逐漸引起學者的關注。在此，我們對ncRNA與HCC的關系進行簡要的綜述。

一、HCC的發生與ncRNA

miRNA是由約22個核苷酸組成的小分子ncRNA，主要通過抑制靶標miRNA轉錄或誘導3′未翻譯區(UTRs)的轉錄互補序列降解來調節基因表達[4]。目前，隨著測序技術的不斷進展，已發現人類基因組中約有2 000個miRNA，并參與調節約30 000個基因的表達及蛋白合成[5]。其中許多miRNA已被證明在正常細胞功能中發揮了關鍵的調控作用[6]。人類癌細胞基因組中常常存在miRNA的表達改變，而且與癌癥的發生及進展密切相關。miRNA與多種促進惡性腫瘤的生物學過程相關，如：凋亡、增殖、血管新生、對信號通路的控制等。大量的研究數據顯示，HCC的發生類似其他惡性腫瘤，經由miRNA影響抑癌及促癌基因的表達來促進HCC的發生[7]。HCC中最顯著的異常表達miRNA包括起上調作用的miR-221、miR-21、miR-18等，以及起下調作用的miR-122a、miR-199a、miR-200等[8, 9]。這些miRNA調控的靶標基因與HCC的發生有潛在關系。

慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)及丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染是導致絕大多數HCC發生的原因。HBV DNA可整合至宿主基因組從而對細胞轉錄進行控制，增加肝細胞致癌的敏感性。miRNA可通過調節HBV本身的基因表達轉錄從而調節HBV感染，進而影響HCC的發生[10]。miR-18a的靶標是雌激素受體α(ER-α)。Liu等[11]的研究顯示，在女性HBV感染者中miR-18a存在過量表達，支持了mir-18a通過ER-α調節的HBV轉錄表達。同時，Zhang等[12]也發現，通過上調miR-152、miR-148或miR-1表達從而調節HDAC4來實現對DNA甲基轉移酶活性的抑制可減弱HBV復制，從而降低HCC風險。此外，miR-196可直接抑制HCV轉錄，從而減少HCC發生的風險。HCC也可發生于非病毒性因素所致肝硬化，如酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)。酒精的攝入與miR-199、miR-200、miR-126等的表達降低相關，這些miRNA的異常表達也可在HCC中觀察到。HCC的另一個危險因素是NASH，已經確證的是NASH可增高發生肝纖維化及HCC的風險。Elton等[13]的研究也發現，在NASH相關的飲食模型的患者中，存在著miR-155表達上調。miR-155可以靶向作用于抑癌基因C/EBP β，同時還可下調HBV病毒的轉錄。

lncRNA的長度變化范圍較大，平均約為592個核苷酸，較mRNA更短(平均2453個核苷酸)[14]。大多數lncRNA存在于細胞核內，參與基因表達的后期調節，可使用如基因芯片或轉錄組分析等生物信息學技術檢出。近年來，逐漸發現lncRNAs在基因表達及信號通路調節中有重要作用。與蛋白編碼基因相似，lncRNA是由染色質標記、獨立基因啟動子、轉錄調控因子及多個外顯子拼接而成的成熟轉錄模板[15]。使用全基因組測序及二代測序技術在鼠體內轉錄組中發現了數以萬計的lncRNA轉錄，這些結果正逐步應用于人ncRNA的研究。與其他RNA相似，lncRNA具有作為疾病或臨床應答的生物學標記的潛在作用。最新的研究顯示，lncRNA是多種惡性腫瘤的重要調節因子，如MALAT1(與轉移性肺腺癌相關)、HOTAIR(HOX反轉錄基因RNA)、H19、 HULC(在HCC中顯著上調)、PRNCR1(前列腺癌非編碼RNA1)等lncRNA在包括HCC在內的多種腫瘤中存在異常表達[16]。如Lai等[17]的研究顯示，MALAT1在HCC中明顯上調且中可促進小鼠模型上HCC發生，提示其具有促進腫瘤細胞侵襲及轉移的能力。在HepG2細胞系中MALAT1的抑制可明顯減少癌細胞的生存力、活力及侵襲能力，并且增強癌細胞凋亡。另一種lncRNA——HOTAIR在HCC組織中的表達存在顯著上調，而且這種升高與HCC患者不良預后也存在相關性[18]。此外，HOTAIR還可下調RNA結合蛋白-38，促進HCC中癌細胞的遷徙。H19基因編碼位于11p15.5上的一段2.3 kb lncRNA，其在母系等位基因上專項表達，并且與生長發育相關的基因突變相關[19]。HULC基因是位于染色體6p24.3上一段長556 bp的核苷酸序列，是最先被描述的在HCC中顯著上調的特異性lncRNA。Du等[20]的重要研究顯示，HBV的HBx蛋白可以通過抑制p18活性來增高HULC表達，從而促進肝癌細胞的增殖與侵襲，在HCC的發生與發展中發揮重要作用。盡管lncRNA對多種重要功能基因的調節效應較為確定及普遍，但是lncRNA在HCC和其他癌癥發生機制中所起的生物學作用尚待深入闡述。

二、ncRNA用于HCC的診斷及預后

大量的研究提示，miRNA作為疾病診斷或預后的生物標志物有著十分重要的臨床意義。包括miRNA、lncRNA在內的多種ncRNA已被證實在HCC或其他類型惡性腫瘤的外周循環或體液中存在著異常表達[21]。外周循環中的大部分miRNA存在于封閉的細胞外囊泡中，這種運輸方式與高密度脂蛋白及Argonaute 2蛋白等相關[22]。miRNA可被血液循環運輸到不同部位，從而對不同靶組織發揮十分復雜多樣的生物學作用。Kogure等[23]的研究顯示，細胞外囊泡內的miRNA可經由HCC組織的細胞間質因子作用而被癌細胞攝取，并發揮相應的調節功能。而部分非囊泡運輸的循環 miRNA的功能效應還未得到闡述，這類特殊的miRNA在HCC中發揮何種功能也仍屬未知。RNA分子通常不被被動機制攝取，而更傾向于通過內源性核酸酶發生退化。因此，檢測在HCC中釋放的循環miRNA情況，可為疾病的診斷及預后提供重要參考。

慢性HBV及HCV感染是引起HCC的主要原因，篩查這些感染患者的HCC特異性生物標記也具有重要臨床價值。HCV相關性HCC中可出現特異性的miR-100、miR-122、miR-221及miR-224表達顯著上調，也已有針對這類miRNA作為診斷標志物的研究進行[24]。循環miR-101也是HBV相關性HCC潛在的生物學標志物，與HCC病理分級及預后顯著相關[25]。此外，檢測HCC組織及循環中特定miRNA的表達也有助于HCC的預后判斷。HCC組織中多種miRNA存在異常表達，如：miR-199a、miR-199b-3p、miR-26及miR-29，且與患者遠期生存有關[26]。此外，Zhang等[27]的研究還發現，HCC中miR-148b的表達降低也與生存預后差有關。Karakatsanis等[28]的研究顯示，miR-21、miR-31、miR-122、miR-221及miR-222在 HCC組織中顯著上調，而且，miR-21、miR-31、miR-122、miR-221的表達上調與肝硬化發生相關，miR-21及miR-221與腫瘤分期及預后相關。但是這些研究大多數都只停留在對臨床現象及相關性的分析，仍缺少對miRNA與HCC發生發展機制的更深入研究探討。

特定類型的惡性腫瘤可存在lncRNA的特異性表達，這也與miRNA相似，提示其也具有診斷、預后或作為治療靶點的潛在價值。如Ishibashi等[18]的研究顯示，高表達HOTAIR(一種lncRNA)的HCC患者較低表達或不表達HOTAIR患者預后更差，同時HOTAIR可預測HCC患者治療后的復發情況，體外細胞試驗也顯示HOTAIR表達上調可使癌細胞增殖更快。此外，HCC風險與多種miRNA的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)相關，如miR-let-7與rs10877887、miR-101-1與rs7536540及miR-34b與rs4938723等[29, 30]。與HCC相關的lncRNA的SNP研究數據較少得到報道，但是與癌癥相關定位于非編碼區的SNP可通過lncRNA的轉錄異常表現出來[31]。然而多種ncRNA相關的SNP研究的結果并不一致，可能與研究的種族背景不同有關，ncRNA的差異性表達及功能改變是否與特定位點的SNP相關仍需更深入的研究。

三、靶向ncRNA的HCC治療

雖然外科手術或肝移植是HCC治療的最主要方法，但是大多數HCC患者診斷明確時即為晚期，無法進行手術或移植，預后極差。針對這類患者的全身或局部治療可有效延緩HCC進展。靶向HCC中的異常表達lncRNA，可能更好地用于區分對藥物治療敏感的患者，為臨床提供全新的治療方式。miRNA可能抑制多個基因的表達，從而調控與HCC生長相關的多個信號通路[32]。HCC中顯著表達的miRNA是miR-21，其過量表達與腫瘤進展及不良預后有關[33]。另一些其他miRNA，如：miR-151及miR-221/222在HCC患者中表達顯著增加，也可以作為介入治療的潛在靶點[34]。同樣，通過調節HCC中干擾抑癌基因的miRNA的方法，也是阻止HCC惡化的有效方法。Chen等[35]的研究發現，使用特異性抗體來沉默miR-221表達，可阻止原位癌動物模型腫瘤的進展，增加總體存活率。因此，沉默miR-221可減少HCC中癌細胞的擴散，增強細胞凋亡，導致惡性細胞復制周期終止。

病毒感染的前提與HCC的發生有特定關系，治療調整與肝炎病毒和HCC相關的ncRNA的表達，可能潛在減緩疾病進展及HCC的發生。Diaz等[24]的研究發現HCV相關HCC中特異性表達18種 miRNA，與其它肝病相比具有高度特異性，未來靶向這些miRNA可能有助于預防甚至治療HCV相關HCC。miR-122是肝細胞特異性miRNA，通過與HCV基因5′-UTR上兩個關聯位點的相互作用，調節HCV RNA的穩定性，從而刺激HCV復制。因此，miR-122在慢性HCV感染中的靶向治療極具吸引力。I、 II期臨床試驗使用miR-122寡核苷酸抗體靶向結合miR-122，顯示了對HCV復制的強效抑制性及安全性[36]。一個交替的辦法是使用小分子來調節HCV中的miR-122。目前有多種方法可用于miRNA表達的調控，包括抑制miRNA及替換miRNA，從而調節下游相關基因的表達。miRNA替換在miRNA折疊時完成，而通過siRNAs可靶向抑制miRNA表達。此外，通過導入具有多靶向miRNA結合位點的載體，可以作為底物競爭性抑制靶向miRNA表達[37]。lncRNA也表現出作為治療靶點的潛在價值。H19作為一類具有致癌lncRNA，在HCC中存在高表達。靶向H19治療已在在患有胰腺、膀胱、卵巢腫瘤患者中進行評估，用于HCC的研究也獲得了批準。調節干預HCC相關lncRNA表達的方法與前面描述的miRNA的方法類似。相較其他類型的腫瘤，以miRNA或lncRNA為靶點的相關療法在HCC中的應用研究更為廣泛及重要。但是基于這些方法的藥物仍在研究中，從基礎研究到臨床應用的過程仍相對漫長。

四、問題及展望

總的來說，目前大量的研究獲得了與HCC相關的ncRNA的數據信息，且以miRNA為主，其他如lncRNA相關的研究也在不斷拓展中。這類ncRNA的共同特征是在HCC中異常表達，并具有作為HCC診斷、預后及治療生物學標志物的潛在價值。對ncRNAs參與的HCC相關分子機制的深入研究，有助于確定更佳的治療靶點來控制腫瘤的形成及進展。同時，也需要更完善的研究來改進靶向ncRNA的HCC治療方法。

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(本文編輯：張苗)

通信作者：劉朝富，Email：liuchaofu2007@sina.com

(收稿日期：2015-12-23)