熒光光度法測定竹葉柴胡地上部分不同部位總黃酮含量

樊秦娥，胡楊根，葉方

(十堰市太和醫院湖北醫藥學院附屬醫院產科，湖北 十堰 442000)

熒光光度法測定竹葉柴胡地上部分不同部位總黃酮含量

樊秦娥，胡楊根，葉方

(十堰市太和醫院湖北醫藥學院附屬醫院產科，湖北 十堰 442000)

目的 分析竹葉柴胡不同部位總黃酮含量，研究黃酮在柴胡不同部位的分布，為中藥資源合理開發利用提供參考。方法以蘆丁為對照品，以5%硝酸鋁與樣品中黃酮成分產生絡合反應，選擇激發波長λex=445 nm，發射波長λem=484 nm，應用熒光光度法測樣品的熒光光度值，計算總黃酮含量。結果以蘆丁在0.198～3.168 μg/mL范圍內與熒光強度線性關系良好，y=0.972 8x-0.001，r2=0.999 3。竹葉柴胡花、葉、莖中總黃酮含量最分別為3.08%、1.85%、0.41%。結論竹葉柴胡花、葉中總黃酮含量較高，應在開花期采收竹葉柴胡地上部分。

竹葉柴胡；總黃酮；熒光光度法

柴胡為傘形科柴胡屬多年生草本植物，最早收載于《神農本草經》，原名茈胡，具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽氣的功效，《中國藥典》收載(北)柴胡Bupleurum chinense DC.和南柴胡(狹葉柴胡)B.scorzoneri folium Willd.作為正品柴胡[1]，但除大葉柴胡外，很多其他柴胡品種在藥材市場上也作為柴胡廣泛應用[2]。鄂西北地區主要分布竹葉柴胡(Bupleurum marginatum Wall ex DC)，習慣以北柴胡之名遠銷國內外，品質較好[3]。柴胡中主要含有皂苷類和黃酮類活性成分，皂苷類成分具有解熱、抗炎、鎮靜、鎮痛、保肝、抗腫瘤等藥理作用，黃酮類成分具有殺菌、抗病毒等作用[4-6]，黃酮類化合物主要分布在植株的地上部分[7]，竹葉柴胡植物地上部分占植株的比例較大，生產中通常都被丟棄，造成了資源浪費。為了更好地利用中藥資源，進一步考察不同部位黃酮成分分布情況，我們對地上部分花、莖、葉中總黃酮含量進行分析比較，為開發利用地上部分提供參考。

1 儀器與材料

F-7000熒光光譜儀(日立)；GZX-9240MBE電熱鼓風干燥箱(上海博弈實業有限公司醫療設備廠)，MBE-20A 1000克密封型搖擺式粉碎機(溫嶺市邁邦機械設備有限公司)，SQP分析天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司)，KQ-250D型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，SHZ-DⅢ循環水式多用真空水泵(河南宇科自動化儀器儀表設備有限公司)，旋轉蒸發器RE-52A(上海亞榮生化儀器廠)。

柴胡藥材采自湖北醫藥學院百草園，由湖北醫藥學院藥學院葉方副教授鑒定，見表1。去雜質，枯枝，洗凈，45℃烘干，粉碎，過3號篩備用。蘆丁對照品(GR-133-140106)購自南京廣潤生物制品有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，水為自制超純水，其他試劑均為分析純。

表1 柴胡樣品及來源、含量測定結果(n=3)

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品10 mg于50 mL容量瓶中，用60%的乙醇溶解并稀釋至刻度，冷藏儲存備用。

2.2 樣品溶液的制備 精密稱取柴胡樣品粉末1 g，置于50 mL圓底燒瓶中，加石油醚25 mL，70℃水浴回流2 h，棄石油醚液，藥渣揮干石油醚后加60%乙醇30 mL，70℃回流提取2 h，濾過，60%乙醇洗滌藥渣和容器，合并濾液轉移至50 mL容量瓶中，加60%乙醇稀釋至刻度[8]得溶液A1～A5。從A1～A5中精密量取5 mL置50 mL容量瓶中，以60%乙醇稀釋至刻度，得到供試品溶液B1～B5。

2.3 測定方法及測定波長的選擇 精密量取0.5 mL對照品溶液于10 mL容量瓶中，加入5%硝酸鋁溶液1 mL，pH=5的HAc-NaAc緩沖溶液3 mL，用60%乙醇稀釋至刻度[9]。精密量取B1溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中，同法操作。根據蘆丁等黃酮類成分在酸性條件下與硝酸鋁反應產生熒光物質的特點，取兩種溶液進行激發光譜和發射光譜掃描：固定激發波長(λex)，掃描發射波長(λem)在200～700 nm范圍內蘆丁對照品及樣品溶液熒光強度，結果最佳λem為484 nm，見圖1；固定λem484 nm，掃描λex在200～700 nm范圍內蘆丁對照品及樣品溶液熒光強度，結果最佳λex為445 nm，見圖2～圖4。因此，確定測定波長：激發波長為445 nm，發射波長484 nm，狹縫寬度為5 nm。

圖1 固定激發波長，掃描對照品發射波長

圖2 固定發射波長，掃描對照品激發波長

圖3 固定激發波長，掃描樣品發射波長

圖4 固定發射波長，掃描樣品激發波長

2.4 線性關系考察 準確吸取此溶液0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.6 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入5%的硝酸鋁溶液1 mL，pH=5的醋酸-醋酸鈉緩沖液3 mL。用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即配成標準工作溶液。以60%乙醇溶液作空白對照，按“2.3”項下操作，測定熒光強度。以熒光強度對相應的濃度作圖，繪制標準曲線。結果蘆丁的線性回歸方程為：y=0.972 8x-0.001，r2=0.999 3，說明在0.198～3.168 μg/mL范圍內蘆丁濃度與其熒光強度呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 精密量取蘆丁對照品溶液0.5 mL，按照“2.3”項下操作，連續測定熒光強度5次，記錄熒光強度值。結果RSD為0.24%，說明儀器精密度良好。

2.6 重現性試驗 取同一樣品6份，按樣品測定方法操作，測定熒光強度。結果RSD為0.92%，表明方法重現性良好。

2.7 穩定性試驗 取同一樣品溶液在0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h內測定熒光強度，結果RSD為0.89%，表明樣品供試品溶液在4 h內檢測對結果無影響，穩定性良好。

2.8 加樣回收試驗 精密稱取蘆丁對照品21.04 mg，稀釋至50 mL量瓶中，得到0.42 mg/mL的對照品溶液。精密稱取4號樣品0.5 g于50 mL圓底燒瓶中，加入5 mL 0.42 mg/mL的對照品溶液，依次按照“2.2”及“2.3”方法處理進行加樣回收試驗，計算加樣回收率(n=6)，結果平均回收率為97.91%，相對標準偏差為1.33%，見表2。

2.9 樣品測定結果 精密吸取供試品溶液B1～B5各0.5 mL于10 mL容量瓶中，按“2.3”方法測定熒光光度值，以60%乙醇溶液作為空白對照，計算樣品中總黃酮的含量，樣品1（生長部位：葉，2年）總黃酮含量0.35%；樣品2（生長部位：葉，1年）1.85%；樣品3（生長部位：花，1年）3.08%；樣品4（生長部位：莖，1年）0.41%；樣品5（生長部位：莖，2年）0.95%。

表2 蘆丁加樣回收率

3 討 論

竹葉柴胡莖、葉、花中總黃酮含量測定結果顯示，1年生柴胡花中總黃酮含量最高，為3.08%，葉中總黃酮含量為1.85%，莖中總黃酮含量最低，只有0.41%。2年生柴胡花中總黃酮沒有檢測，但2年生柴胡葉中總黃酮含量低于1年生，而莖中含量高于1年生柴胡，1年生柴胡莖葉中黃酮總量高于2年生柴胡，說明柴胡不同部位黃酮類成分的累積規律與生長周期的變化不呈相關性。如果以柴胡總黃酮作為主要療效成分時，應在一年生柴胡開花期采收，同時由于莖中總黃酮含量較低，所以在種植中可以通過給柴胡打頂收集柴胡葉和花作為原料，即能保證柴胡主要藥用部位根莖的生長，還能綜合利用資源。

[1]國家藥典委員會.中國藥典[M].北京:中國醫藥科技出版社,2015: 280-281.

[2]梅贊,楊杰,范慧佳,等.4種柴胡地上部分黃酮類成分的含量測定[J].中國新藥雜志,2011,20(10):932-935.

[3]杜士明,葉方,楊光義,等.鄂西北地區柴胡資源調查研究[J].中藥材,2012,35(6):866-869.

[4]陳亞雙,孫世偉.柴胡的化學成分及藥理作用研究進展[J].黑龍江醫藥,2014,27(3):630-633.

[5]譚利,張慶英,李教社,等.南柴胡根中木脂素苷類化合物的研究[J].藥學學報,2005,40(5):428-431.

[6]楊柳,王雪瑩,劉暢.北柴胡化學成分與藥理作用的研究進展[J].中醫藥信息,2012,29(3):143-144.

[7]譚玲玲,侯曉敏,胡正海.狹葉柴胡營養器官中柴胡皂苷和黃酮類化合物的積累部位及含量比較[J].西北植物學報,2014,34(2): 276-281.

[8]巴吐爾·買買提明,李月紅,海力茜·陶爾大洪,等.熒光分析法測定巖黃芪根中的總黃酮含量[J].光譜實驗室,2011,28(3):1302-1305. [9]馬登磊,邵建群,何深知,等.熒光分析法測定元寶楓葉中總黃酮含量的研究[J].首都醫科大學學報,2014,35(1):113-117.

Determination of total flavonoids in different aerial parts of Bupleurum marginatum by fluorescence spectrophotometry.

FAN Qin-e,HU Yang-gen,YE Fang.Department of Obstetrics,the Affiliated Hospital of Hubei Medical College(Taihe Hospital of Shiyan),Shiyan 442000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo establish a method to determine the total flavonoid levels in flower,leaves and stalk of Bupleurum marginatum by Spectrofluorimetry,and to provided a reference for reasonable development and utilization of traditional Chinese medicine resources.MethodsBased on fluorescent property that flavonoids could make a stable complexation with Al3+,and the excitation and emission wavelengths were selected at 445 nm and 484 nm respectively with rutin as the standard sample.The total flavonoids levels were determined in the sample by fluorescence spectrophotometry.ResultsThe fluorescence intensity had a good linear relationship with rutin concentration in the range of 0.198～3.168 μg/mL.The regression equation was found to bey=0.972 8x-0.001,r2=0.999 3.The content of flavonoids in flower,leaves and stalk were 3.08%,1.85%,0.41%,respectively.ConclusionThe flower,leaves of Bupleurum marginatum contain relatively higher levels of total flavonoids,which provides a reference for harvesting the aerial parts of Bupleurum marginatum in flowering period.

Bupleurum marginatum;Total flavonoids;Fluorescence spectrofluorimetry

R93

A

1003—6350（2016）20—3319—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.20.017

2016-04-22)

胡楊根。E-mail：wuerfan@sina.com