參附注射液對糖尿病大鼠缺血再灌注損傷心肌DJ-1表達的影響

孔曉東，夏中元，周斌，孟慶濤

(武漢大學人民醫院麻醉科，湖北 武漢 430060)

參附注射液對糖尿病大鼠缺血再灌注損傷心肌DJ-1表達的影響

孔曉東，夏中元，周斌，孟慶濤

(武漢大學人民醫院麻醉科，湖北 武漢 430060)

目的 觀察參附注射液(SFI)對糖尿病大鼠缺血再灌注損傷(IR)心肌DJ-1表達的影響，并探究其對糖尿病IR心肌保護作用的分子機制。方法健康雄性SD大鼠腹腔注射60 mg/kg鏈尿佐菌素制備糖尿病模型。取糖尿病造模成功大鼠30只，隨機數字表法分為三組(n=10)：假手術組(S組)、IR組、IR+SIF組。心肌IR模型采用結扎冠脈左前降支(LAD)30 min后松開120 min制備，S組只穿線包繞LDA而不結扎。IR+SFI組開胸前SFI以10 mL·kg-1·h-1持續泵注，開胸后以3 mL·kg-1·h-1持續輸注至手術結束，其余兩組泵注等量晶體液。檢測SD大鼠心梗面積、血清肌酸激酶-MB(CK-MB)含量、心肌DJ-1表達，超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。結果與S組比較，IR組大鼠的心梗面積[(49.0±5.3)%vs(0.0±0.0)%]，CK-MB[(1 982±275)U/L vs(1 076±262)U/L]、MDA[(13.1±1.9)nmol/mg vs(7.6±1.1)nmol/mg]含量顯著增加，差異均有統計學意義(P＜0.05)，而DJ-1表達[(0.65±0.14)vs(1.0±0.0)]和SOD活性[(79.0±19.3)U/mg vs(143±15.4)U/mg]顯著降低，差異均具有統計學意義(P＜0.05)；與IR組相比，IR+SFI組大鼠的心梗面積[(35.7±5.3)%vs(49.0±5.3)%]，CK-MB[(1 364±228)U/L vs (1 982±275)U/L]和MDA[(7.3±1.25)nmol/mg vs(13.1±1.9)nmol/mg]含量顯著降低，差異均有統計學意義(P＜0.05)，而DJ-1表達[(0.9±0.14)vs(0.65±0.14)]和SOD活性[(119.4±14.6)U/mg vs(79.0±19.3)U/mg]顯著降低，差異均有統計學意義(P＜0.05)。結論SFI能顯著降低糖尿病心肌IR損傷的易損性，其機制可能與其上調心肌DJ-1表達、增強內源性抗氧化應激有關。

參附注射液；心肌缺血再灌注損傷；糖尿病；DJ-1；氧化應激

缺血性心臟病是糖尿病患者主要的心血管并發癥及首要的致死原因。循證醫學資料表明，與非糖尿病患者相比，糖尿病患者一旦出現心肌缺血，其發生缺血再灌注(IR)損傷程度更重，預后更差，死亡率可達到非糖尿病患者的2～4倍[1]。DJ-1是近年發現的一種新型癌基因，研究顯示它在對抗機體氧化應激方面扮演了十分重要的角色[2]，新近有證據表明，糖尿病心肌中DJ-1表達明顯下調，這可能是糖尿病IR心肌易損性增加的重要原因[3]。參附注射液(SFI)是根據我國古典配方提取的中醫急救藥物，研究發現SFI對損傷臟器具有保護作用，亦有學者表明，SFI在糖尿病IR心肌的保護方面發揮了重要作用[4]，但具體機制尚未完全闡述明確。本文擬觀察SFI對糖尿病IR心肌中DJ-1蛋白表達及氧化應激水平的影響，探討SFI減輕糖尿病IR心肌易損性的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要材料 SPF級健康雄性SD大鼠，8周齡(體質量200～220 g)，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。鏈脲佐菌素(STZ)、戊巴比妥鈉、TTC、伊文思藍(美國，Sigma公司)，參附注射液(SFI，三九藥業)，肌酸激酶-MB(CK-MB)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)ELISA檢測試劑盒(武漢，Elabscience公司)，兔抗鼠DJ-1一抗(美國，CST公司)。

1.2 糖尿病大鼠模型的建立 大鼠適應性喂養3 d，禁食12 h，采用腹腔單次注射STZ 60 mg/kg制備1型糖尿病大鼠模型，72 h檢測尾靜脈采血空腹血糖≥16.7 mmol/L為造模成功，之后每周檢測血糖一次。所有動物均飼養于武漢大學人民醫院動物房，采用普食喂養，自由飲水。

1.3 大鼠分組及給藥 糖尿病模型誘導成功8周后，取30只大鼠按隨機數表法分為3組(n=10)：假手術組(S組)、IR組和IR+SFI組。IR+SFI組于開胸前經股靜脈持續泵注SFI 10 mL·kg-1·h-1，開胸后改為3 mL·kg-1·h-1，其余兩組開胸前后持續泵注等量晶體液[4]。

1.4 心肌IR損傷模型的制備 腹腔注射1%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉后固定，行氣管切開插管術，接DW-2000型動物呼吸機機械通氣。皮下心電監測Ⅱ導聯心電圖。開胸后暴露心臟，采用6-0結扎線包繞冠狀動脈左前降支(LAD)根部。穩定15 min后采用結扎LAD 30 min后松開結扎線再灌注120 min的方式制備心肌IR模型。LAD結扎成功標準為：心電圖ST段進行性抬高，心尖變白，左室壁運動受限。再灌注成功標準為：ST段回落，心尖復紅。S組只穿線不結扎LAD。

1.5 心梗面積測定 再灌注結束后原位重新結扎LAD，股靜脈注入3%伊文思藍1 mL，待心臟充分染成藍色后迅速摘取心臟，立即置于-20℃下冷凍30 min，于特制凹槽內沿心臟長軸方向將其切成2 mm薄片，置于1%TTC中37℃恒溫中染色15 min。正常心肌染成藍色，危險區心肌磚紅色，梗死區心肌為白色。掃描，用Image-ProPlus6.0軟件計算缺血區和梗死區面積。

1.6 血清CK-MB檢測 再灌注結束時取右頸動脈血2 mL，4℃離心取上清液，采用ELISA法檢測血清CK-MB水平。

1.7 心肌DJ-1表達測定 取左室組織，RIPA裂解液裂解，充分勻漿，于4℃離心15 min，取上清，用BCA法測蛋白濃度。免疫印跡時加上樣緩沖液，煮沸5 min，行SDS-PAGE電泳，濕轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，于兔抗鼠DJ-1抗體，GAPDH抗體4℃孵育過夜；于羊抗兔熒光二抗室溫孵育1 h；使用Odyssey紅外掃描顯影儀掃描并分析測定灰度值。

1.8 心肌SOD活性、MDA含量檢測 再灌注結束后，取左室組織，采用ELISA法檢測心肌SOD活性，MDA水平。

1.9 統計學方法 應用SPSS17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 SFI對心梗面積和血清CK-MB的影響 與IR組比較，IR+SFI組心肌梗死面積顯著減小(P＜0.05)；IR組血清CK-MB含量顯著高于S組，但SFI能顯著降低IR組CK-MB含量(P＜0.05)，見表1。

2.2 SFI對心肌DJ-1蛋白表達的影響 與S組比較，IR組心肌DJ-1蛋白表達明顯降低(P＜0.05)。與IR組比較，IR+SFI組心肌DJ-1蛋白含量顯著增加(P＜0.05)，見表1和圖1。

圖1 SFI對糖尿病IR心肌DJ-1蛋白表達的影響

2.3 SFI對心肌SOD活性和MDA含量的影響 與S組比較，IR組心肌SOD活性顯著下降，MDA含量顯著增加；而SFI能顯著增加IR心肌SOD活性，降低MDA含量(均P＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠心梗面積、血清CK-MB、心肌DJ-1蛋白、SOD和MDA含量比較(n=6，±s)

表1 各組大鼠心梗面積、血清CK-MB、心肌DJ-1蛋白、SOD和MDA含量比較(n=6，±s)

注：IR組心梗面積與IR+SIF組比較，t=3.99。與S組比較，aP＜0.05；與IR組比較，bP＜0.05。

組別DJ-1蛋白S組IR組IR+SFI組F值P值心梗面積(%) 0.0±0.0 49.0±5.3 35.7±5.3b173.6＜0.000 1 CK-MB (U/L) 1076±261.7 1982±275.1a1364±228.0b16.39 0.000 4 1.0±0.0 0.65±0.14a0.90±0.14b13.04 0.001 SOD (U/mg) 143.1±15.4 79.0±19.3a119.4±14.6b19.17 0.000 2 MDA (nmol/mg) 7.6±1.1 13.1±1.9a7.3±1.2b24.43＜0.000 1

3 討 論

由于高血糖、高血脂以及活性氧自由基積聚，早期的糖尿病患者即可出現典型心肌病變，表現為心肌肥大、心臟舒張和收縮功能障礙等。此類患者一旦發生缺血性心臟病，其危害性和致死率遠高于非糖尿病患者。本研究參照Xue等[5]的方法，采用腹腔注射STZ誘導1型糖尿病大鼠模型，通過結扎LAD 30 min開放120 min的方法建立心肌IR模型，以完成后續研究。

SFI是紅參和附子的提取物，其主要有效成分包含人參皂甙和烏頭堿類。研究表明人參皂甙有較強的抗心肌IR損傷作用，且在動物試驗和臨床研究中得到了廣泛的證實，其機制可能涉及減輕細胞內Ca2+超載、清除氧自由基、抗脂質氧化反應、抑制炎癥介質產生、改善缺血心肌組織微循環等。此外，SFI還具有降血糖等抗糖尿病的作用[6-7]。在本研究中，我們發現SFI能顯著減少糖尿病IR心肌的梗死面積，降低血清CK-MB水平，提示SFI具備抗糖尿病心肌IR損傷的作用，這與我們及他人的前期研究相一致。

DJ-1(PARK7)是近年來細胞生物學和病理生理學等相關學科的重要發現，作為一種新型癌基因，它廣泛存在于人體的大腦、心臟、腎臟等臟器中。研究發現它編碼的DJ-1蛋白是一種多功能蛋白，在維持人體正常生理活動及介導疾病的發生發展中發揮了十分重要的作用[8]，近年來其抗氧化應激的功能特性成為探討熱點。研究顯示，DJ-1可通過自身結構和生化特異性、分子伴侶特性、胞核和線粒體穩定性等對抗機體的氧化應激水平[8]。Taira等[9]研究發現，DJ-1基因敲除后，細胞中與氧化應激、凋亡、細胞毒性等有關的基因表達增高，細胞對氧化應激的易損性增強。Liu等[3]在糖尿病大鼠中的研究發現，糖尿病心肌DJ-1的表達較正常心肌明顯降低，這可能是糖尿病心肌氧化應激水平增高的重要原因之一。進一步的研究發現，糖尿病IR心肌中DJ-1的表達更加減少，這與本研究的結果相一致。此外，我們研究顯示，SFI在增加糖尿病心肌對IR耐受性的同時，伴隨著心肌組織DJ-1的顯著上調，經過對氧化應激指標的檢測，我們發現，SFI能顯著增加心肌SOD活性，并降低心肌MDA含量。

綜上所述，SFI可有效地減輕糖尿病IR心肌的易損性，其機制可能與其上調心肌DJ-1蛋白表達，從而減輕心肌細胞氧化應激水平有關。

[1]Beckman JA,Paneni F,Cosentino F,et al.Diabetes and vascular disease:pathophysiology,clinical consequences,and medical therapy: partⅡ[J].Eur Heart J,2013,34(31):2444-2452.

[2]Mccoy MK,Cookson MR.DJ-1 regulation of mitochondrial function and autophagy through oxidative stress[J].Autophagy,2011,7(5): 531-532.

[3]Liu M,Zhou B,Xia Z Y,et al.Hyperglycemia-induced inhibition of DJ-1 expression compromised the effectiveness of ischemic postconditioning cardioprotection in rats[J].Oxid Med Cell Longev,2013, 2013:564902.

[4]夏中元,江夢,肖業達,等.參附注射液對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注時PTEN和P13 K表達的影響[J].中華麻醉學雜志,2009,29(6): 490-493.

[5]Xue R,Lei S,Xia ZY,et al.Selective inhibition of PTEN preserves ischaemic post-conditioning cardioprotection in STZ-induced type 1 diabetic rats:role of the PI3K/Akt and JAK2/STAT3 pathways[J]. Clin Sci(Lond),2016,130(5):377-392.

[6]Yang LJ,Wang J,Tian ZF,et al.Shenfu injection attenuates neonatal hypoxic-ischemic brain damage in rat[J].Neurol Sci,2013,34(9): 1571-1574.

[7]Guo ZJ,Li CS.Therapeutic effects of Shenfu Injection on post-cardiac arrest syndrome[J].Chin J Integr Med,2013,19(9):716-720.

[8]Dongworth RK,Mukherjee UA,Hall AR,et al.DJ-1 protects against cell death following acute cardiac ischemia-reperfusion injury[J]. Cell Death Dis,2014,5:e1082.

[9]Taira T,Takahashi K,Kitagawa R,et al.Molecular cloning of human and mouse DJ-1 genes and identification of Sp1-dependent activation of the human DJ-1 promoter[J].Gene,2001,263(1-2):285-292.

Effect of Shenfu injection on expression of DJ-1 in ischemia reperfusion myocardium of diabetic rats.

KONG Xiao-dong,XIA Zhong-yuan,ZHOU Bin,MENG Qing-tao.Department of Anesthesiology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of Shenfu injection(SFI)on expression of DJ-1 in diabetic ischemia reperfusion(IR)myocardium,and explore the mechanisms of its cardioprotection.MethodsType 1 diabetes models were induced by a single intraperitoneal of 60 mg/kg streptozotocin in healthy male SD rats(weighing 200-220 g),and confirmed by fasting blood glucose≥16.7 mmol/L.Thirty diabetic rats were randomly assigned into 3 groups(n=10 each):sham group(S group),IR group and IR+SFI group.Myocardium IR model was established by occlusion of the anterior descending branch of left coronary artery(LAD)for 30 min followed by 120 min reperfusion. LAD was exposed but not occluded in S group.In IR+SFI group,SFI was continuously pumped into femoral vein with 10 mL·kg-1·h-1before opening chest,and after that,it was continuously pumped with 3 mL·kg-1·h-1.Crystal injection was pumped in parallel in the other two groups.After 120 min reperfusion,hearts were removed for determination of infarct size,DJ-1 expression,superoxide dismutase(SOD)activity and malonaldehyde(MDA)release.Blood was collected for creatine kinase-MB(CK-MB)assay.ResultsCompared with S group,larger myocardium infarct size,higher CK-MB and MDA release,lower DJ-1 expression and SOD activity were detected in IR group,(49.0± 5.3)%vs(0.0±0.0)%,(1 982±275)U/L vs(1 076±262)U/L,(13.1±1.9)nmol/mg vs(7.6±1.1)nmol/mg,(0.65±0.14)vs (1.0±0.0),(79.0±19.3)U/mg vs(143±15.4)U/mg,P＜0.05.Compared with IR group,SFI significantly reduced myocardium infarct size,CK-MB and MDA release,and increased DJ-1 expression and SOD activity in IR+SFI group, (35.7±5.3)%vs(49.0±5.3)%,(1 364±228)U/L vs(1 982±275)U/L,(7.3±1.25)nmol/mg vs(13.1±1.9)nmol/mg,(0.9± 0.14)vs(0.65±0.14),(119.4±14.6)U/mg vs(79.0±19.3)U/mg,P＜0.05.ConclusionSFI can decrease the vulnerability of diabetic myocardium to IR injury.The mechanism is probably involving in DJ-1 activation,and then enhancing the ability of endogenous antioxidation.

Shenfu injection;Myocardianl ischemia reperfusion injury;Diabetes;DJ-1;Oxidative stress

R-332

A

1003—6350（2016）20—3273—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.20.002

2016-05-14)

國家自然科學基金(編號：81471844)

夏中元。E-mail：xiazhongyuanmz@aliyun.com