骨髓間充質干細胞對繼發性骨質疏松大鼠骨缺損愈合的影響

高翔，陳廣謀，黃成碩，劉志軍，曾榮，楚佳奇，李鵬

(1.廣東醫科大學附屬醫院干細胞研發與細胞治療中心，廣東 湛江 524001；2.廣東醫科大學附屬醫院微創骨科研究室，廣東 湛江 524001)

·論 著·

骨髓間充質干細胞對繼發性骨質疏松大鼠骨缺損愈合的影響

高翔1，陳廣謀2，黃成碩2，劉志軍2，曾榮2，楚佳奇1，李鵬1

(1.廣東醫科大學附屬醫院干細胞研發與細胞治療中心，廣東 湛江 524001；2.廣東醫科大學附屬醫院微創骨科研究室，廣東 湛江 524001)

目的探討骨髓間充質干細胞(BMSCs)在繼發性骨質疏松性的個體骨缺損愈合過程中的作用。方法采用全骨髓貼壁分離法培養原代BMSCs細胞，并使用流式細胞儀檢測及使用成骨成脂特異性染色鑒定培養的BMSCs；選取60只雌性SD大鼠，通過肌注地塞米松(DEX，1 mg·kg-1·d-1)8周，建立大鼠骨質疏松模型。所有大鼠經手術于脛骨平臺下鉆孔造骨缺損模型，將大鼠隨機分成三組：對照組(NS組，骨折不處理)、DEX骨折+生理鹽水(NS)組、DEX+BMSCs組，將BMSCs注射到大鼠骨缺損部位治療(采用生理鹽水進行對照)，于術后4周和8周，采用Micro-CT檢測各組大鼠的骨缺損愈合情況。結果經流式細胞表型鑒定及成骨成脂特異性染色實驗均證實分離得到的細胞是BMSCs。Micro-CT結果表明，與DEX+NS組比較，BMSCs細胞治療能促進DEX誘導的骨質疏松性骨折的愈合。結論BMSCs對繼發性骨質疏松性大鼠的骨缺損具有顯著的促進愈合作用，這為臨床治療繼發性骨質疏松個體的骨損傷提供了一種新的研究思路。

SD大鼠；骨質疏松；骨髓間充質干細胞；骨缺損

糖皮質激素(glucocorticoid，GC)是由腎上腺皮質束狀帶合成和分泌的一類甾體激素，由于其強大的抗炎和免疫抑制等作用，在臨床治療中應用十分廣泛，但是長期使用卻會引起骨量丟失，繼而導致糖皮質激素性骨質疏松(glucocorticoid induced osteoporosis，GIOP)的發生[1]。有研究表明GIOP患者發生骨折的風險是正常人的兩倍[2]，并且骨折的風險與激素的使用呈劑量依賴性[3]。骨折是GIOP最嚴重的并發癥之一，嚴重者還會導致殘疾，給家庭和社會帶來巨大的經濟負擔[4]。GIOP患者的骨損傷(骨缺損或骨折)后愈合困難，目前對于此類患者的有效藥物治療較少，也存在易誘發腫瘤、價格昂貴等問題[5]。近年來，越來越多的學者關注利用干細胞強大的組織修復能力對骨質疏松及骨損傷修復治療[6]。骨髓基質干細胞(bone mesenchymalstem cells，BMSCs)是一種自我更新和多向分化能力的成體干細胞，是成骨細胞的源頭細胞，特定條件下，BMSCs可以向成骨細胞分化，進而生成骨細胞發揮成骨作用[7]。此外，BMSCs具有易獲得、低免疫原性、可移植性、組織修復能力等生物學特性[8]。隨著科學技術的發展，這些生物學特性為BMSCs在再生醫學中的應用奠定了基礎，對治療骨質疏松和修復骨缺損具有重要意義。因此，本實驗擬采用全骨髓貼壁分離法體外分離大鼠BMSCs，通過利用BMSCs的干預治療來觀察BMSCs對治療骨質疏松性大鼠骨缺損的影響，以期為BMSCs的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 SPF級SD大鼠購于廣西醫科大學實驗動物中心；胰蛋白酶、低糖DMEM培養基、胎牛血清(Gibco，美國)；茜素紅染液、成脂誘導培養基，油紅O染液(賽業生物，中國)；地塞米松、β-甘油磷酸鈉和抗壞血酸(Sigma，美國)；PE標記的大鼠來源的抗CD29、CD44、CD31、CD45、CD34、CD90及IgG(BD，美國)。

1.2 儀器設備 MEDI LINK雙能X線骨密度檢測儀(Osteospace，法國)；倒置顯微鏡(Leica，德國)；Micro-CT 40(Scanco，瑞士)；高速冷凍離心機(Thermo，美國)；流式細胞儀(BD，美國)。

1.3 方法

1.3.1 繼發性骨質疏松性骨缺損模型的建立方法 選取雌性12周SD大鼠60只，隨機分為三組，每組20只，分別為對照組(NS組，骨缺損不處理)、DEX骨缺損+生理鹽水組(DEX+NS組)、DEX骨缺損+ BMSCs治療組(DEX+BMSCs組)。除對照組骨缺損不處理組外，其余兩組大鼠使用肌內注射地塞米松1 mg·kg-1·d-1，3次/周，持續8周，建立GIOP模型，對照組骨折不處理組采用肌內注射生理鹽水1 mL·kg-1·d-1作為對照，給藥方案與地塞米松造模相同。8周后檢測大鼠股骨骨密度，然后所有大鼠進行雙側脛骨骨缺損手術：用低速骨鉆在大鼠脛骨平臺下外側鉆約2.0 mm的圓孔缺損，缺損應達到骨髓腔，但不穿透對側皮質，向骨髓腔中注射BMSCs(數量為1×106個/20μL)/生理鹽水20μL。骨缺損手術后進行常規抗感染處理，肌內注射1 000 000 U青霉素/只大鼠。大鼠術后第2天開始正常喂養，大鼠于術后第3天、第4周和第8周使用活體顯微CT成像系統觀察分析骨缺損愈合情況。

1.3.2 BMSCs原代分離及培養 選取4～6周SPF級SD大鼠，頸椎脫臼處死后浸泡于75%乙醇消毒5～10 min后于超凈臺中取其兩側的股骨脛骨，并剪去上下兩端，暴露骨髓腔，用L-DMEM完全培養基(含10%胎牛血清)反復沖洗骨髓腔，收集細胞懸液于15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入L-DMEM完全培養基輕輕吹打成單細胞懸液并接種

1.3.3 BMSC表面分子鑒定 選取P3代生長狀態良好的細胞，0.25%胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞2～3次，1 000 r/min離心5 min后用PBS重懸細胞制成單細胞懸液分裝于離心管(EP管)中，每支EP管分別加入PE標記的大鼠來源的抗CD29、CD44、CD31、CD45、CD34和CD90，對照組加入同型對照，混勻。室溫避光孵育30 min，離心棄上清，PBS洗去未標記抗體，每管加入400μL PBS重懸細胞，利用流式細胞術進行BMSC鑒定。

1.3.4 BMSCs成骨誘導實驗 選取P3代BMSCs接種于十二孔板中，待細胞貼壁生長至細胞密度達到90%～100%時，分別加入成骨誘導培養基或完全培養基，每3 d換液一次，細胞誘導14 d后，70%乙醇固定15 min，使用茜素紅進行染色，而后用倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.3.5 BMSCs成脂誘導實驗 選取P3代BMSCs接種于十二孔板中，分別加入成脂誘導培養基或完全培養基，每3 d換液一次，細胞誘導14 d后，4%多聚甲醛固定15 min，使用油紅O進行染色，而后用倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.3.6 骨密度檢測 大鼠肌注地塞米松或生理鹽水8周后，對大鼠股骨部位進行骨密度掃描分析，確認骨質疏松造模是否成功。

1.3.7 Micro-CT法對骨微結構的檢測 術前、術后第3天、4周及8周分別對大鼠進行骨微結構掃描。大鼠經水合氯醛麻醉后固定于Micro-CT掃描管中，確定掃描范圍，沿骨長軸方向利用Micro-CT進行掃描，掃描條件為：電壓70 kVp，電流114 μA，掃描分辨率2048×2048。選取感興趣區域和重建閾值：該實驗選取大鼠脛骨手術部位為重建區域，重建閾值均為190，對所有掃描股骨的區域進行三維重建。分析數據和圖片。

2 結 果

2.1 BMSCs表面標志物的表達 流式細胞儀檢測結果顯示，CD44、CD29和CD90在BMSCs中高表達，陽性率分別為95.7%、99.7%和99.8%，而CD31、CD45、CD34低表達，陽性率僅為1.2%、0.8%和0.4%，見圖1。

圖1 大鼠骨髓間充質干細胞表面標志物的表達情況

2.2 BMSCs成骨和成脂誘導分化鑒定 BMSCs成骨誘導培養14 d后，茜素紅染色結果顯示細胞間質內含大量礦鹽沉積的鈣化結節呈紅色(圖2A)；成脂誘導培養14 d后，油紅O染色可見胞漿內出現較多紅色脂滴并合并成串珠狀(圖2B)。

圖2 大鼠骨髓間充質干細胞成骨成脂誘導情況

2.3 大鼠肌注DEX和NS前后骨密度的測定 大鼠通過肌注DEX來建立GIOP模型。肌注后大鼠股骨的骨密度顯著低于DEX肌注前和NS肌注后(圖3A)；Micro-CT分析結果也顯示與NS肌注后比較，DEX肌注后大鼠骨微結構惡化，骨小梁厚量降低(圖3B)。結果證明GIOP模型建模成功。

2.4 SD大鼠繼發性骨質疏松性骨缺損愈合情況 Micro-CT成像可用于反映骨痂的連續性和測量骨痂容積，礦化比例。與DEX+NS組比較，DEX+ BMSCs組在術后4周時顯示出更好的骨痂連續性；術后8周，DEX+BMSCs組骨缺損愈合處的骨小梁密度和粗細均一程度均高于DEX+NS組，骨缺損間隙的橋梁骨痂完全骨化，骨折端之間形成骨連接，與對照組恢復情況基本相同，提示重建修復情況良好(圖4)。

圖3 SD大鼠股骨骨密度(g/cm3)

圖4 Micro-CT檢測不同時間段各組大鼠骨缺損手術后愈合情況

3 討 論

本研究采用1 mg·kg-1·d-1地塞米松，3次/周，連續肌內注射8周后，模型組大鼠骨密度顯著降低(P＜0.01)，骨微結構惡化，骨小梁厚量降低，成功建立大鼠骨質疏松模型。本研究在骨質疏松大鼠上進行脛骨骨缺損手術力求模擬臨床上骨質疏松患者的骨損傷。從最終顯微CT的分析結果可知，骨質疏松大鼠骨缺損后，其愈合過程較正常大鼠延遲大約4周。正常大鼠骨缺損僅需要4周時間，缺損部位基本修復完全，而骨質疏松大鼠則需要8周時間才能基本完成缺損部位修復。

骨質疏松性骨折(osteoporosis fracture，OPF)是骨質疏松癥最嚴重的并發癥[9]，因此OPF在治療及愈合過程除了單純的外科治療外更應該需要重視骨質疏松(OP)的治療[10]。糖皮質激素(GC)長期使用引起骨質疏松的主要原因之一是GC對成骨細胞的抑制作用[11]，GIOP患者由于成骨作用不足，在其發生骨損傷的情況下，成骨能力的不足造成骨骼愈合的緩慢。因此解決骨質疏松患者骨損傷愈合延遲的關鍵在于提高患者的成骨作用。成骨細胞和成骨作用直接相關，成骨細胞增多或成骨細胞活性增強均可提高成骨作用。

近年來，隨著組織工程學和細胞治療學的興起，干細胞移植治療OPF已成為研究熱點。因為骨髓基質干細胞是成骨細胞的祖細胞，具有良好的成骨細胞分化潛能和成骨活性，可在細胞因子刺激下轉化成為成骨細胞，所以BMSC作為骨組織修復手段的研究日益增多。大量研究表明通過移植BMSCs來治療骨折后的骨不連癥狀，多數取得積極的效果[12]。Uejima等[13]將同種異體的BMSCs注射到去卵巢骨質疏松大鼠模型的股骨髓腔中，可以顯著提高該區域的骨密度，增強生物力學強度。Takada等[14]在SAMP6模型鼠中注射同種異體骨髓至小鼠脛骨骨髓腔中，打破了破骨細胞與成骨細胞的平衡，提高了骨組織細胞的數量和質量，增加了該區域的骨密度。這些實驗都證明可以用BMSCs移植手段來達到治療骨質疏松的目的。

本實驗通過采用全骨髓貼壁法分離、培養大鼠BMSCs后，通過流式細胞技術檢測BMSCs表面標志物的表達，細胞表面抗原鑒定，以及使用茜素紅和油紅O染色鑒定的方法，確定本次研究所使用的細胞為BMSCs。采用制備的已鑒定的BMSCs對骨質疏松性大鼠骨缺損進行治療干預后，Micro-CT結果顯示，治療4周后，骨質疏松性大鼠骨缺損部位已經大部分愈合，所形成的骨痂明顯較生理鹽水對照組大鼠多，治療8周之后，DEX+BMSC組大鼠骨缺損愈合情況優于NS組，BMSCs組骨折線完全消失，骨折間隙的橋梁骨痂完全骨化，骨折端之間形成骨連接，已進入骨折端的塑形期，基本恢復正常骨骼形態，而DEX+NS組，骨痂尚未完全骨化，尚處于骨性愈合期。這些結果證明BMSCs可促進骨痂的形成，加快骨損傷的愈合過程。患者骨骼損傷時會觸發一系列響應修復機制，調動沉睡的成骨前體細胞、骨襯細胞和骨髓基質干細胞等轉化為成骨細胞啟動骨骼修復，其中骨髓基質干細胞轉化為成骨細胞途徑是骨骼修復時成骨作用的重要來源。本實驗通過治療干預增加骨折修復所需的BMSC，s可極大地提供額外的成骨修復作用，對抗GC的成骨抑制作用，加快骨損傷的修復進程。

綜上所述，BMSCs的干預治療可顯著改善GIOP骨折股骨骨密度，加速骨折愈合時間，為BMSCs的臨床應用提供理論依據。隨著研究的不斷深入，基質干細胞未來將為臨床骨損傷的治療提供一種新的途徑。

[1]Suzuki Y.Glucocorticoid-induced osteoporosis[J].Nihon Rinsho, 2015,73(10):1733-1739.

[2]Fujiwara S.Glucocorticoid and bone.Fracture risk of steroid-induced osteoporosis[J].Clin Calcium,2014,24(9):1295-1300.

[3]Vestergaard P,Rejnmark L,Mosekilde L.Fracture risk associated with different types of oral corticosteroids and effect of termination of corticosteroids on the risk of fractures[J].Calcif Tissue Int,2008, 82(4):249-257.

[4]Seibel MJ,Cooper MS,Zhou H.Glucocorticoid-induced osteoporosis:mechanisms,management,and future perspectives[J].Lancet Diabetes Endocrinol,2013,1(1):59-70.

[5]Lewiecki EM.Safety of long-term bisphosphonate therapy for the management of osteoporosis[J].Drugs,2011,71(6):791-814.

[6]Zou Q,Hong W,Zhou Y,et al.Bone marrow stem cell dysfunction in radiation-induced abscopal bone loss[J].J Orthop Surg Res,2016,11 (1):3.

[7]Saeed H,Iqtedar M.Bone marrow stromal cell(BMSC)and skeletal aging:role of telomerase enzyme[J].Pak J Pharm Sci,2014,27(2): 321-333.

[8]Bradamante S,Barenghi L,Maier JA.Stem cells toward the future: The space challenge[J].Life(Basel),2014,4(2):267-280.

[9]Cawthon PM,Shahnazari M,Orwoll ES,et al.Osteoporosis in men: findings from the osteoporotic fractures in men study(MrOS)[J]. TherAdv Musculoskelet Dis,2016,8(1):15-27.

[10]Feron JM,Mauprivez R.Fracture repair:general aspects and influence of osteoporosis and anti-osteoporosis treatment[J].Injury, 2016,47 Suppl 1:S10-14.

[11]劉衍志,陳艷,高翔,等.塞來昔布對大鼠骨組織的影響[J].藥學研究,2014,33(7):373-375.

[12]李鵬,黃成碩,高翔,等.大鼠骨髓間充質干細胞體外分離及對原發性骨質疏松性骨折的實驗研究[J].國際檢驗醫學雜志,2015,36 (14):1984-1987.

[13]Uejima S,Okada K,Kagami H,et al.Bone marrow stromal cell therapy improves femoral bone mineral density and mechanical strength in ovariectomized rats[J].Cytotherapy,2008,10(5): 479-489.

[14]Takada K,Inaba M,Ichioka N,et al.Treatment of senile osteoporosis in SAMP6 mice by intra-bone marrow injection of allogeneic bone marrow cells[J].Stem Cells,2006,24(2):399-405.

Effect of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on bone defect healing in rats with secondary osteoporosis.

GAO Xiang1,CHEN Guang-mou2,HUANG Cheng-shuo2,LIU Zhi-jun2,ZENG Rong2,CHU Jia-qi1,LI Peng1.1.Stem Cell Research and Cellular Therapy Center,Affiliated Hospital of Guangdong Medical University,Zhanjiang 524001,Guangdong,CHINA;2.Department of Orthopedic Surgery,Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Zhanjiang 524001,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo assess the therapeutic effect of bone marrow-derived mesenchymal stem cells(BMSCs)in bone defect healing in rats with secondary osteoporosis.MethodsPrimary BMSCs were cultured by whole bone marrow adherence method,and the BMSC was detected and identified by flow cytometry and osteogenic specific staining.Sixty female SD rats were selected and injected intramuscularly of dexamethasone(DEX,1 mg·kg-1·d-1)for 8 weeks to establish rat models of osteoporosis.Then the rats were drilled under the tibial plateau to establish bone defect models.The rat models were randomly divided into three groups,control group NS group(fracture was not treated), DEX fracture combined with saline(DEX+NS group),DEX fracture combined with BMSCs treatment group(DEX+ BMSCs group).BMSCs were injected into the bone defect site for treatment(saline was used as control).Micro-CT was used to detect bone defect healing of the rats in each group 4 and 8 weeks after surgery.ResultsFlow cytometry and osteogenic specific staining both confirmed that the isolated cells were BMSCs.Micro-CT results showed that BMSCs treatment can promote the healing of osteoporotic fracture induced by DEX,compared with DEX fracture combined with NS.ConclusionBMSCs has a significant role in promoting the healing of bone defect in secondary osteoporotic rats,which provides a new approach for clinical treatment of individual bone defect in the patients with secondary osteoporosis.

Sprague-Dawley rat;Osteoporosis;Bone mesenchymal stem cells(BMSCs);Bone defect

R-332

A

1003—6350（2016）20—3269—04

2016-05-10)

廣東省自然科學基金(編號：S2013020012866)；廣東省湛江市科技計劃項目(編號：2014A06005)；廣東醫學院科研基金面上培育項目(編號：M2014048、M2015013)

李鵬。E-mail：lipeng5155703@163.com