mTOR信號通路在神經膠質瘤干細胞樣細胞中激活的意義研究

李志營 夏云 王占偉 楊偉科 焦繼超

·實驗研究·

mTOR信號通路在神經膠質瘤干細胞樣細胞中激活的意義研究

李志營 夏云 王占偉 楊偉科 焦繼超

目的探討哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路在神經膠質瘤干細胞樣細胞中激活的意義。方法通過Hoechst33342染色流式細胞儀,利用Western blot法和熒光定量-PC R法對非側群(NSP)細胞和側群(SP)細胞中的mTOR信號通路在神經膠質瘤干細胞樣細胞中激活的意義進行分析研究。結果光定量PCR檢測NSP和SP細胞中,mTOR基因的2-△Ct值為(0.289±0.042)和(0.623±0.021),兩者差異有統計學意義(P＜0.05),Western blot檢測結果證實,SP細胞的mTOR蛋白表達也明顯高于NSP細胞(P＜0.05)。結論神經膠質瘤干細胞中存在mTOR高表達現象。

mTOR信號通路；神經膠質瘤；干細胞

惡性腫瘤是除心血管疾病以外,人類健康的第二大殺手,而神經膠質瘤又是惡性腫瘤中最為常見的一種類型,主要治療方式為手術治療,但患者存在一定的術后復發率,術后死亡率也相對較高。腫瘤干細胞理論研究結果提出,腫瘤內存在的部分腫瘤起始細胞是惡性腫瘤發生、發展、復發的主要原因,而這也為腫瘤的預防和治療提供了新的途徑。本次醫學研究就對mTOR信號通路在神經膠質瘤干細胞樣細胞中激活的意義進行了研究,現報告如下。

1 材料與方法

1.1細胞系及培養 細胞系及其培養方法: 用5%二氧化碳在37℃條件下進行神經膠質瘤C6細胞的培養,PRMI 1640培養液中含有100 IU/ml鏈霉素、100 IU/ml青霉素及10%胎牛血。

1.2試劑 本研究所用試劑包括: 美國 cell signalling 公司生產的mTOR、GAPDH抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗,北京天根生化科技(北京)有限公司生產的Trizol、SYBR Green 熒光定量檢測 PCR 試劑盒,美國 Santa Cruz 公司生產的特異性mTOR 靶向 siRNA,英韋創津公司生產的Lipofectin2000、PRMI 1640 培養基,美國Millopore 公司生產的干細胞培養基,美國 Gibco 公司生產的胎牛血清,美國Sigma 公司生產的Hoechst33342和維拉帕米、鏈霉素、青霉素。

1.3熒光定量 PCR 檢測mTOR 基因表達 分別選擇NSP和SP細胞,PBS進行2次洗滌,根據Trizol 說明書要求對細胞總 RNA進行提取,反轉錄出第 1 鏈cDNA,根據 SYBR Green 熒光定量 PCR 檢測試劑盒說明書要求,進行 mTOR 基因表達量的檢測。使用2-△Ct值表示基因的表達量,Ct值表示基因擴增達到閾值的循環數,△Ct值越小,則證實基因的表達就越多,相應的2-△Ct值越小就說明該基因的表達就越少,△Ct值=目的基因Ct值-內參基因Ct值。

1.4側群(SP)細胞的流式細胞儀分選 按照Goodell等研究人員提出的方案,對SP細胞的流式細胞儀進行分選,具體如下方法: 選擇對數生長期的神經膠質瘤C6細胞,在5 mg/L的Hoechst 33342中加入106/ml單細胞懸液,同時,提前30 min選擇1 ml細胞,并加入50 mg/L維拉帕米,后加入Hoechst 33342 作為對照,選擇相應的SP亞群,連續90 min在37℃的水浴避光染色。通過美國BD 公司生產的IL6 和 IL7 雙通道做門FACS AriaⅡ流式細胞儀,參考維拉帕米對照樣品對SP細胞群進行選擇,并在37℃無菌條件下分選。

1.5統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示,采用t檢驗;計數資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

熒光定量PCR檢測結果證實,在NSP和SP細胞中,mTOR基因的2-△Ct值為(0.289±0.042)和(0.623±0.021),兩個檢測結果比較差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖1。Western blot檢測結果證實,SP細胞的mTOR蛋白表達也明顯高于NSP細胞。見圖2。

圖1 熒光定量PCR檢測,NSP和SP細胞的mTOR表達

圖2 Western blot檢測,NSP和SP細胞的mTOR表達

3 討論

腫瘤干細胞是一種具有自我更新潛能和高增生潛能的一小群腫瘤起始細胞,現階段臨床常用的腫瘤干細胞分選方法包括Hoechst 33342 染色流式細胞儀SP 細胞分選、無血清球囊懸浮培養富集、免疫標記分選幾種［1］,其主要原因是特異性標記的腫瘤干細胞蛋白在特定的腫瘤中并不顯著,血清懸浮培養條件較為嚴苛,但耗時相對較少［2］,因此,SP細胞分選也是腫瘤干細胞的常見分選方法,已有的醫學研究結果證實,SP細胞分選是一種最為簡便且有效的富集神經膠質瘤腫瘤干細胞分選技術［3］。

mTOR信號通路對于細胞周期的調節、細胞的增值和生長具有十分重要的作用,其存在于腫瘤及其基因的發生和發展的全過程之中,且這一過程中mTOR 通路的激活起到了明顯的促進作用［4,5］。mTOR屬于核心絲氨酸 /蘇氨酸蛋白激酶的一種,能夠使其底物 pS6K和 4E-BPl磷酸化,產生轉錄因子效應,進而加速蛋白質的翻譯,其中包括一些促生長、細胞周期調控、抗凋亡等蛋白的表達。

［1］張宇,傘永志,朱玉蘭.mTOR信號通路在中樞神經系統疾病中的作用機制研究進展.卒中與神經疾病,2013,20(6):381-382.

［2］王通,劉玉光,張良文,等.阻斷EGFR和mTOR信號通路對C6膠質瘤及其干細胞的影響.山東大學學報,2013,7(5):37-38.

［3］周福安,古麗娜爾·阿布拉江,張志明,等.PI3K/AKT/mTOR信號轉導通路相關蛋白在腦膠質瘤中的表達及臨床意義.臨床神經病學雜志,2012,25(4):278-279.

［4］李雪源,賈愛華,任玉波,等.mTOR 信號通路蛋白在人腦膠質瘤中的表達及其臨床意義.中國腫瘤生物治療雜志,2011,18(1):75-76.

［5］李進軍,劉顯志,王雪峰,等.mTOR /eIF4E信號通路在不同級別人腦膠質瘤組織中的表達及臨床意義.第三軍醫大學學報,2010,32(23):2549-2550.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.08.224

2016-12-29］

450000 河南省鄭州市第七人民醫院神經外科