肺炎支原體對大環內酯類抗生素耐藥性及耐藥機制研究

馮真英 葉少玲 陳文興 姚小軍

肺炎支原體對大環內酯類抗生素耐藥性及耐藥機制研究

馮真英 葉少玲 陳文興 姚小軍

目的探析肺炎支原體對大環內酯類抗生素的耐藥性及其耐藥機制。方法130例社區獲得性肺炎患者,取其急性期咽拭子標本,行肺炎支原體分離培養,采用聚合酶鏈反應(PCR)進行分離株分子鑒定；采用微量稀釋法檢測肺炎支原體對大環內酯類抗生素的最低抑菌濃度(MIC),行23SrRNA基因測序,并與標準菌株MPFH(ATCC 15531)基因序列進行對比分析。結果130例社區獲得性肺炎患者咽拭子標本中,分離出20株(15.4%)肺炎支原體；對大環內酯類抗生素藥物均存在耐藥性,其耐藥機制為23SrRNA基因位點突變。結論肺炎支原體對大環內酯類抗菌藥物具有嚴重的耐藥性,其耐藥機制主要是23SrRNA基因位點突變。

肺炎支原體；大環內酯類抗生素；最低抑菌濃度；耐藥

肺炎支原體(MP)是臨床小兒呼吸道感染的常見病原體,其引發的肺炎和肺外并發癥嚴重危害患者的健康和生命。因此,探尋最佳的治療方案具有重要的臨床意義。臨床治療肺炎支原體感染多以大環內酯類抗生素較為常見［1］,但近些年,大環內酯類抗生素長期廣泛的臨床應用,已有報道表明肺炎支原體耐藥株的產生,同時藥物自身的不良反應,使臨床治療效果欠佳［2］。本次研究探討肺炎支原體對大環內酯類抗生素的耐藥性及其耐藥機制,現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本院2013年6月～2015年8月收治的社區獲得性肺炎患者130例,其中男68例、女62例,年齡15～78歲,平均年齡(47.2±11.5)歲。入選標準：符合中華醫學會呼吸病學會制定的成年人《社區獲得性肺炎診斷和治療指南》關于肺炎的診斷標準［2］：患者年齡≥14周歲,X線或CT檢查顯示肺部出現新浸潤影,且符合①新出現的咳嗽癥狀加重；②體溫＞37.8℃或＜35.6℃；③外周白細胞總數＞10×109/L或＜4× 109/L的三者之一。排除標準：①免疫抑制性疾病或已接受免疫抑制劑治療者；②發病時間＞1周；③孕婦或哺乳期；④90 d內有住院史且住院時間＞2 d；患者均簽署知情同意書。

1.2 采集標本 患者入院后當日,采集其急性期咽拭子,置于肺炎支原體保存液的無菌保存管中,凍存于-80℃送檢。

1.3 肺炎支原體培養 采用變色培養基液體培養法,以基礎肉湯培養基、培養添加劑自配的變色培養基,取200 μl置入咽拭子標本液中,加入2ml變色培養基中,于37℃溫度下培養2～6周,顏色由澄清紅變為澄清黃判定為陽性［3］,反之為陰性；對獲得培養陽性菌株行MP-PCR鑒定。

1.4 藥敏試驗 采用SP4液體培養基,以微量稀釋法檢測肺炎支原體對紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素、米諾環素、四環素、加替沙星、莫西沙星、環丙沙星、左氧氟沙星的MIC。采用PCR法擴增檢測肺炎支原體23SrRNA全序列,并與標準菌株MPFH (ATCC 15531)基因序列對比。

2 結果

2.1 肺炎支原體分離率 130例咽拭子標本中,共分離出20株(15.4%)肺炎支原體,均行PCR法鑒定。

2.2 肺炎支原體對抗菌藥物的敏感性 20株肺炎支原體對大環內酯類抗生素均存在耐藥性,耐藥率為100%,其耐藥機制為23SrRNA基因位點突變；四環素、氟喹諾酮類未見耐藥株；喹諾酮類中加替沙星、莫西沙星存在著良好的體外抗肺炎支原體活性,其MIC值顯著低于環丙沙星、左氧氟沙星。肺炎支原體藥物敏感試驗結果見表1,表2。

表1 20株肺炎支原體體外藥物敏感試驗的MIC值(μg/ml)

表2 20株肺炎支原體體外藥物敏感試驗的MIC值(μg/ml)

3 討論

MP是臨床呼吸道感染的常見病原體,對大環內酯類抗生素較為敏感。近些年,肺炎支原體的耐藥現象逐漸增多,且有研究報道顯示,已分離出對大環內酯類抗生素的耐藥菌株,而其耐藥的主要機制為23SrRNA基因突變。大環內酯類抗生素是臨床放線菌屬細菌的次級代謝產物［4］,結構特征以14～16元環大環內酯為母核,糖苷鍵和1～3分子糖相連接,其中紅霉素是14元環大環內酯的代表性藥物,另還有克拉霉素、竹桃霉素等；阿奇霉素是15元環大環內酯類代表藥物；大環內酯類抗生素的抗菌機制為蛋白合成抑制劑,對核糖體有共同的結合位點,可抑制核糖體上的蛋白質合成。

大量臨床研究顯示,病原體細胞中核糖體的23SrRNA含有肽酰轉移酶,能催化肽鍵的合成,進而合成蛋白質；大環內酯類抗生素則能與酶的催化中心Ⅴ區的核苷酸相作用,抑制細菌蛋白質的合成。多聚肽鏈合成的肽轉移酶中心A2058位是紅霉素作用的關鍵位點,其作用基團與各基因相結合,并分別形成氫鍵。另有研究表明［5］,大環內酯類抗菌藥物還可抑制病原體50S核糖體的組裝,進而抑制細菌蛋白質的合成。由于肺炎支原體分離培養的難度較大,對其耐藥機制的研究主要由抗生素體外誘導的耐藥株、臨床分離株中獲得。目前,研究認為大環內酯類抗生素的滅活機制為：①靶位的改變,如基因突變或甲基化；②主動外排；③藥物的滅活。而結合位點的基因突變是引起肺炎支原體耐藥的主要機制之一。

人工體外誘導獲得的耐藥株的耐藥機制主要是23SrRNA基因突變。早前有學者研究發現,紅霉素誘導獲得的兩株耐藥菌株中有2063位由A到G點突變,有2064位A到G點突變；其中2063位點突變的菌株耐藥表型為14元環的大環內酯類耐藥,2064位點突變的菌株耐藥表型為16元環的大環內酯類耐藥［6］。另有學者報道顯示：體外紅霉素誘導的耐藥菌株存在2063位A到G和2064位A到G的點突變,誘導藥物的濃度與突變模式無關,其耐藥表型主要取決于點突變的部位［3］。上述突變都在23SrRNA的Ⅴ區,而其他大環內酯類抗生素的作用位點未發現有點突變,23SrRNA的Ⅱ區也未發現點突變。本次研究結果顯示：130例社區獲得性肺炎患者咽拭子標本中,分離出20株(15.4%)肺炎支原體；對大環內酯類抗生素藥物均存在耐藥性,耐藥率高達100%,而其耐藥機制為23SrRNA基因位點突變。

綜上所述,肺炎支原體對大環內酯類抗菌藥物具有嚴重的耐藥性,其耐藥機制主要是23SrRNA基因位點突變。而近些年,隨著檢測技術的進步發展,新型耐藥機制有待進一探討研究。

［1］韓旭,辛德莉,馬少杰,等.耐藥肺炎支原體肺炎患兒的臨床特點.實用兒科臨床雜志,2010,25(16):48-49.

［2］朱翠明,劉艷,劉丹.突變敏感性分子開關檢測肺炎支原體對大環內酯類抗生素的耐藥性研究.中國人獸共患病學報,2015,31(5):73-74.

［3］胡荊江,陳玲,覃軍.兒童肺炎支原體突變體對大環內酯類藥物耐藥的研究.國際呼吸雜志,2015,35(19):17-18.

［4］史大偉,辛德莉.肺炎支原體體外誘導抗生素耐藥及其機制.國際兒科學雜志,2010,37(1):86-87.

［5］吳勇兵,王瑞瓊,張暢斌,等.96例小兒肺炎支原體感染情況及耐藥性分析.國際醫藥衛生導報,2012,18(13):74-75.

［6］黃榕,陽愛梅,宋建輝,等.1026例兒童肺炎支原體感染及耐藥情況分析.中國當代兒科雜志,2013,15(7):26-27.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.13.096

2016-04-06］

524003 湛江市第二人民醫院(馮真英 葉少玲陳文興)；第二軍醫大學研究生四隊(姚小軍)