不同臨床類型肝病患者血清中自身抗體的檢測及臨床應用

周曉冬，錢宏波，劉會利，白妙，趙漢東，劉紅莉

(西安市第八醫院檢驗科，陜西 西安 710061)

不同臨床類型肝病患者血清中自身抗體的檢測及臨床應用

周曉冬，錢宏波，劉會利，白妙，趙漢東，劉紅莉

(西安市第八醫院檢驗科，陜西 西安 710061)

目的 分析不同臨床類型肝病患者血清中各種自身抗體的存在狀況，探討其臨床應用價值。方法采用間接免疫熒光法和免疫印跡法，對我院2010年6月至2014年2月3 124例不同類型肝病患者和200例正常健康體檢者血清中的抗核抗體(ANA)、抗線粒體抗體(AMA)、抗平滑肌抗體(ASMA)、抗肝腎微粒體抗體(LKM)和自身免疫肝病譜等9項指標進行檢測。結果病毒性肝炎ANA、AMA陽性率分別為11.11%、0.39%，抗肝抗原自身抗體檢測陽性率分別為AMA M22.22%，M2-3E 1.86%、Sp100 0.59%、PML 0.42%、gp210 3.81%、LKM-1 0.62%、LC-1 2.28%、SLA-LP 0.26%、Ro52 10.6%。自身免疫性肝病ANA、AMA陽性率分別為90.63%、78.13%,抗肝抗原自身抗體檢測陽性率分別依次為71.87%，71.87%、6.25%、6.25%、65.63%、3.13%、0、21.88%、93.75%。與病毒性肝炎比較，自身免疫肝病的9項指標以及ANA、AMA的差異有統計學意義(P＜0.01)。與正常對照組比較，丙肝、自身免疫肝病、藥物性肝炎的ANA陽性率的差異有顯著統計學意義(P＜0.01)。甲肝、戊肝、脂肪肝血清中未檢測出自身抗體。與病毒性肝炎比較，藥物性肝炎的ANA檢出率差異有顯著統計學意義(P＜0.01)。各型肝炎患者ANA的熒光模型存在差異。結論檢測自身抗體的類型、滴度以及熒光模型對于不同類型肝病的診斷和治療具有臨床參考價值。

病毒性肝炎；抗核抗體；自身免疫肝病；自身抗體；臨床應用

自身抗體是指針對自身組織、器官、細胞及細胞成分的抗體。正常人體血液中存在低滴度的生理性自身抗體，不引發疾病，當其滴度升高到一定水平，機體的免疫耐受平衡被破壞，引起組織臟器受損，導致自身免疫疾病發生。我國是慢性肝炎的高發區，自1970年首次報道某些結接性多動脈炎患者與乙肝病毒感染相關后肝炎病毒與自身免疫的相關性得到關注，病毒性肝炎的發生和發展可能涉及對自身抗原的免疫應答，包括自身抗體應答和自身反應性T細胞應答。因此了解不同類型肝炎患者自身抗體的狀況，有利于臨床合理用藥，也利于和自身免疫性肝病的鑒別。為探討各類肝病患者血清中自身抗體的存在狀況和臨床應用價值，我們檢測并統計了3 124例不同肝病患者的多項自身抗體，現將檢測分析結果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 3 124例患者均來自2010年6月至2014年2月西安市第八醫院的住院患者，男性2 035例，年齡11～74歲；女性1 089例，年齡17～77歲；其中病毒性肝炎3067例(包括乙肝2 120例，丙肝928例，乙丙肝11例，戊肝5例，甲肝3例)、自身免疫性肝病32例、藥物性肝炎17例以及脂肪肝8例。所有入選的確診病例中病毒性肝炎的診斷，符合2000年《病毒性肝炎防治方案》，排除其他自身免疫性疾病；自身免疫肝病的診斷，參照國際自身免疫肝病小組修訂的評分標準。以200例各型肝炎血清標志物陰性，并且肝功能正常的健康體檢者作為正常對照組，其中男性107例，女性93例，年齡16～46歲。

1.2 研究方法

1.2.1 間接免疫熒光法(Indirect immunofluo rescence,IIF)：采集患者靜脈血液，分離血清。用德國歐蒙醫學實驗診斷股份有限公司生產的肝臟馬賽克4進行檢測。該試劑盒包被有4種抗原基質：Hep-2、猴肝、大鼠胃、大鼠腎臟。可檢測抗核抗體(Anti-nuclear antibody，ANA)、抗平滑肌抗體(Anti-smooth muscle antibody，ASMA)、抗線粒體抗體(Anti-mitochondrial antibody，AMA)、抗肝腎微粒體抗體(Liver kidney microsomal antibody，LKM)。按試劑盒要求操作，用熒光顯微鏡觀察細胞或組織內出現特異性綠色熒光，血清稀釋度大于等于1:100判為陽性。

1.2.2 免疫印跡法 采用歐蒙肝抗原譜9項試劑條檢測血清中自身抗體，包括丙酮酸脫氫酶復合物(AMA M2)、BPO線粒體內膜α-2酮酸脫氫酶E-2亞基的融合蛋白(M2-3E)、核顆粒蛋白(Sp100)、早幼粒細胞白血病蛋白(PML)、核膜整合蛋白(gp210)、肝腎微粒抗體Ⅰ型(LKM-1)、肝細胞溶質抗原Ⅰ型(LC-1)、可溶性肝抗原(SLA/LP)、Ro52等自身抗體。血清按照1:100稀釋，全部操作按照試劑盒步驟，用歐蒙公司的計算機程序(EURO Line Scan)自動判讀條帶的陰陽性和著色強度。

1.2.3 ANA和AMA的結果判定 在熒光顯微鏡下ANA陽性時Hep-2細胞的細胞核、細胞漿、細胞膜上出現各種不同的熒光，并結合猴肝上相應的熒光判定；AMA陽性時Hep-2細胞胞漿呈現顆粒狀熒光、大鼠腎近曲小管和遠曲小管均有明顯的熒光、大鼠胃壁細胞呈明顯熒光、猴肝細胞質上呈細沙狀熒光。

1.3 統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行數據分析，各項檢測結果陽性率以百分率表示，單項陽性率間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各類肝病患者的ANA、AMA、ASMA、LKM檢測結果 乙肝、丙肝、乙丙肝、自免肝病、藥物性肝炎的ANA陽性率分別為9.39%、15.08%、18.18%、90.63%、29.41%，乙肝比對照組高5.39%，差異無統計學意義(P＞0.05)；丙肝、乙丙肝、自免肝病、藥物性肝炎與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)；自免肝病、藥物性肝炎與病毒肝炎組比較差異有顯著統計學意義(P＜0.01)；乙、丙肝ANA以低滴度(1:100)為主，自免肝病、藥物性肝炎、乙丙肝ANA以高滴度(≥1:320)為主。自身免疫性肝病AMA陽性率為78.13%(≥1:320)，與乙肝、丙肝的AMA陽性率0.09%、1.08%比較差異有顯著統計學意義(P＜0.01)。乙肝、丙肝、自免肝病ASMA陽性率分別為0.05%、0.43%、3.12%。乙肝、自免肝病LKM陽性率分別為0.05%、3.12%。甲肝、戊肝及脂肪肝中未檢測出自身抗體，見表1。

表1 3 124例肝病患者自身抗體熒光檢測結果[例(%)]

2.2 不同臨床類型肝病患者肝抗原譜9項的檢測結果 乙肝、丙肝的患者血清中9種肝抗原譜抗體呈現不同的陽性率；甲肝、戊肝、脂肪肝患者均未檢測到任何自身抗體；自身免疫性肝病患者的AMAM2(78.13%)、M2-3E(78.13%)、gp210(65.63%)、SLA/LP (21.88%)、Ro52(93.75%)顯著高于對照組和病毒性肝炎組(P＜0.01)；藥物性肝炎患者AMAM2(23.53%)、gp210(11.76%)、Ro52(17.65%)明顯高于對照組；乙丙肝患者AMAM2(18.18%)、M2-3E(18.18%)、gp210 (18.18%)，見表2。

2.3 各類肝炎ANA和AMA熒光模型分析 乙肝的ANA熒光模型以均質型、核顆粒型、核仁型為主。丙肝的ANA熒光模型以均質型、核顆粒型、胞漿顆粒型為主。藥物性肝炎的核型為胞漿顆粒型、核仁型和核顆粒型。乙丙肝有核顆粒型和核仁型兩種。乙肝、丙肝、自身免疫肝病中可見混合核型。自身免疫性肝病的ANA熒光模型有胞漿顆粒型、核點型、著絲點型、核顆粒型、核仁型、均質型和胞漿纖維型，AMA陽性時的ANA的熒光模型有胞漿顆粒性、核點型和著絲點型，見表3。

表2 3 124例肝病患者肝抗原抗體檢測結果[例(%)]

表3 378例ANA陽性的熒光模型分析[例(%)]

2.4 32例自身免疫性肝病分型 25例原發性膽汁性肝硬化(PBC)表現為ANA陽性(胞漿顆粒型、著絲點型、核點型)、AMA陽性(基質大鼠腎和大鼠胃細胞線粒體呈顆粒狀熒光)、AMAM2、M2-3E 2、gp210、Ro52均強陽性；5例自身免疫性肝炎(AIH)Ⅲ型有2例表現為ANA陽性(核顆粒型、核仁型)、SLA/LP強陽性；1例AIHⅡ型ANA陽性(胞漿顆粒型)、LKM陽性(基質大鼠腎細胞線粒體或陰或陽)、LKM-1強陽性；1例AIHⅠ型ANA陽性(胞漿纖維型)、ASMA陽性(基質大鼠胃腺體間收縮纖維呈條索狀熒光)。

3 討 論

自身抗體是指各種原因造成的機體B細胞產生針對自身組織的抗體，也是一類受自身和外界影響不斷變化的抗體，高滴度的自身抗體可導致機體一系列生理和病理改變。本研究通過對不同類型肝炎的自身抗體分析表明病毒、藥物對自身抗體的影響與正常對照有顯著差異，自身免疫性肝病中特異性的自身抗體與病毒性肝炎之間有明顯差異。

3 124例肝病中約98%屬于病毒性肝炎，肝炎病毒感染主要通過機體對病毒的免疫應答而導致肝細胞的損害[1]，其可以直接破壞肝細胞，也能引起靶細胞中的抗原成分改變或者由于病毒蛋白與正常組織成分間有同源性可誘發自身免疫，HCV感染通過分子模擬現象激活自身反應性CD8陽性T細胞，從而誘導產生自身免疫現象[2]。Michalska等[3]研究認為，HBV和HCV感染者體內可產生自身免疫應答并出現多種自身抗體，自身抗體的出現不僅與病毒感染有關，而且與病毒感染的嚴重程度、病程長短密切相關[4]。有文獻報道HBV患者ANA陽性率為13.7%，HCV患者ANA陽性率為15.7%[5]，HAV感染后也可誘發自身免疫性肝臟疾病[6]。本研究證明：HBV、HCV組ANA檢出率分別為9.4%、15.1%，乙肝與上述報道稍有差異，丙肝感染相對乙肝容易誘發自身抗體。乙丙肝混合感染11例并不多見，但ANA中有2例(18.18%)陽性并呈高滴度(≥1:320)，說明肝炎病毒混合感染更容易破壞自身免疫系統，治療上應引起重視。藥物性肝炎17例5例(29.41%)ANA呈高滴度陽性，而且血清中存在的肝抗原抗體AMAM2、3E、Ro52，說明藥物或/及其代謝產物不光引起的肝臟炎癥性損害，也會引起自身免疫系統的改變，提示臨床在用藥過程中及時檢測肝功能和自身抗體的變化。HAV和HEV患者中未檢出自身抗體，可能與我們收集的甲肝、戊肝病例少或地域有關。脂肪肝是因肝細胞內脂肪堆積引起的肝臟病變，故未影響自身免疫系統。

自身免疫性肝病組的ANA檢出率為90.63%，明顯高于病毒性肝炎組11.11%，差異有統計學意義(P＜0.01)。自身免疫性肝病29例ANA滴度全部(100%)為高滴度(≥1:320)，而HBV和HCV中ANA高滴度(≥1:320)僅有22例(1.04%)和19例(2.05%)，說明HBV和HCV感染者ANA滴度以低滴度(1:100)為主。一般認為自身免疫疾病的啟動因子是病毒感染，而乙、丙肝中高滴度的自身抗體與自身免疫性疾病密切相關，病毒性肝炎患者在發病和治療中是否伴有自身免疫現象或誘導產生自身免疫性疾病，這是一個長期動態的變化過程。病毒性肝炎患者在用干擾素抗病毒治療過程中，藥物可誘導或增強自身免疫，若對存在高滴度自身抗體的乙、丙型肝炎患者繼續干擾素治療，可能會誘導或增強自身免疫活性細胞，加重自身免疫性反應[7]，故慢性病毒性肝炎在使用干擾素抗病毒治療前必須排除自身免疫性疾病，對伴有高滴度的自身抗體存在時，選擇治療方案要十分慎重，應在保肝的基礎上進行抗病毒和免疫調節劑的治療。相反，自身免疫性肝病臨床常用激素等免疫抑制劑治療，但免疫抑制劑可抑制機體正常有益的免疫反應，長期使用可導致機體抵抗力下降，誘發嚴重的感染、惡性腫瘤等疾病。所以，若兩類肝病診斷失誤，給予相反的治療將會加重病情[8]。因此，對各類肝病患者進行自身抗體及滴度的監測，對于病毒性肝炎和自身免疫性肝病的認識和鑒別有一定的意義，并可進一步指導臨床合理用藥。

自身免疫性肝病是一種特殊類型的慢性肝病，肝組織的改變與慢性病毒性肝炎相一致，但伴有皮膚瘙癢、關節酸痛、內分泌失調、低熱、干燥綜合征等肝外表現，發展為肝硬化的時間比病毒性肝炎短，不易治愈，血清中可發現與肝臟相關的循環自身抗體[8]，并呈強陽性。自身免疫性肝病患者的肝抗原相關抗體AMAM2、3E、gp210、SLA/LP、Ro52均呈強陽性，明顯高于病毒性肝炎組。線粒體抗體(AMA)陽性是診斷PBC的重要免疫學指標，95%～98%的PBC患者AMA陽性，AMAM2抗體陽性見于90%的PBC[9]。本研究表明25例PBC患者AMA均陽性，其中23例(92%) AMAM2抗體陽性，與上述基本相符。據國內報道，只要AMA抗體和AMAM2抗體陽性的患者，即使沒有臨床癥M2抗體陽性的患者應引起重視，建議定期復查。

ANA熒光模型包括均質型、胞漿顆粒型、核顆粒型、核點型、核膜型、著絲點型等。在本研究中，乙肝和丙肝ANA的熒光模型大多數呈低滴度，沒有明顯的鑒別意義，但自身免疫性肝病的ANA、AMA等熒光模型均為高滴度，可根據熒光模型和特異性肝抗原抗體來分型。國內報道PBC患者AMA抗體陽性的核型分別為顆粒型59.3%，著絲點型22.2%，胞質型18.5%[11]。也有國外報道PBC患者AMA抗體陽性的常見熒光模式為著絲點型、核膜型和核點型，其中核膜型AMA是PBC的一個特異性血清學指標，它們的出現有助于PBC的診斷。本研究25例PBC中AMA的熒光模型為胞漿顆粒型88.0%、著絲點型8.0%、核點型4.0%，與上述報道均不相符，分析原因可能與患者的地域、種族和試劑不同、操作人員的差異有關。

綜上說述，不同類型的肝病患者血清中自身抗體呈不同程度的變化，動態的影響機體自身免疫調節系統，定期檢測自身抗體能為臨床提供重要的診斷和鑒別診斷依據，使患者能夠得到及時合理化的治療。

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Detection and clinical application of autoantibodies in serum of patients with different type of hepatopathy.

ZHOU Xiao-dong,QIAN Hong-bo,LIU Hui-li,BAI Miao ZHAO Han-dong,LIU Hong-li.Department of Clinical Laboratory, Xi'an No.8 Hospital,Xi'an 710061,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo investigate a series of autoantibodies expression in the serum of patients with different clinical types of hepatopathy,and their role in diagnosis and clinical application.MethodsRetrospective analysis was performed in 3 124 patients with different clinical types of hepatopathy and 200 healthy people undergoing health check,who admitted to our hospital from June 2010 to February 2014,to detect antinuclear antibody(ANA),antimitochondrial antibody(AMA),antismooth muscle antibody(ASMA),antiliver-kidney microsomes antibody(LKM),antiliver specific lipoprotein antibody(ALSP)and 9 indexes of antibody in autoimmune liver disease through indirect immunofluorescence and immunoblotting test.ResultsThe positive rates of ANA and AMA of viral hepatitis were respectively 11.11%and 0.39%.Meanwhile,the positive rates of AMA M2,M2-3E,SP100,PML,gp210,LKM-1,LC-1,SLA-LP and Ro50 were respectively 2.22%,1.86%,0.59%,0.42%,3.81%,0.62%,2.28%,0.26%and 10.6%.The positive rates of ANA and AMA of autoimmune liver disease were 90.63%and 78.13%,respectively.And then,the positive rates of AMA M2,M2-3E,SP100,PML,gp210,LKM-1,LC-1,SLA-LP and Ro50 were 71.87%,71.87%,6.25%,6.25%, 65.63%,3.13%,0,21.88%and 93.75%.The positive rates of ANA,AMA,and 9 indexes of antibody in autoimmune liver disease were significantly higher than that of viral hepatitis(P＜0.01).There were significant differences between patients with different clinical type of hepatopathy and healthy people in the positive rate of ANA in Hepatitis C,autoimmune liver disease,and drug-induced hepatitis(P＜0.01).All the autoantibodies were not detected in Hepatitis A,Hepatitis E,and Fatty liver.The positive rate of ANA in drug-induced hepatitis was significantly higher than that of viral hepatitis(P＜0.01).The fluorescence model of ANA was different among all types of hepatopathy.ConclusionThe detection of type,titer,and fluorescence model of autoantibodies in different type of hepatopathy is valuable for improving the diagnosis and therapy.

Viral hepatitis;Antinuclear antibody(ANA);Autoimmune liver disease;Autoantibody;Clinical application

R575

A

1003—6350（2016）10—1602—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.10.018

2015-09-15)

劉紅莉。E-mail：liuhongli@sina.com